原官網的常見問題都先搬到這分類底下

回覆:

不管是冷光還是螢光系統，Excitation/Emission波長至少需差距30nm以上,以避免在機器讀值時互相干擾，以及避免訊號重疊區域太大，影響實驗結果。

回覆:

DLR system只建議使用Passive Lysis Buffer(PLB)，才能確保產生最低background干擾。

請問想用luciferase reporter system，研究cis-regulatory and trans-regulatory in Plants (Rice, Arabidopsis...)。已知reporter gene vector有效表現在哺乳類細胞，那pGL3、pGL4 vector是否適合用在植物系統上?

回覆:

載體是否可以在生物體中表現reporter gene，主要取決於reporter gene上游的promoter而定。所以promoter的序列會決定載體是否可以用在哺乳類細胞或是植物細胞。
目前有的文獻，pGL3、pGL4的載體可以用在植物細胞，此外，原廠有客戶成功使用pNL1.1 vector(and NanoLuc) in Arabidopsis.

回覆:

KpnI 對BufferA、J 酵素活性最好，NotI則是Buffer D、H，兩者不建議混在一起使用，因為反應的Buffer不同。
其使用的先後順序，建議從Buffer中的NaCl濃度低者優先使用，反應完後可用Clean up再加第二種限制酶。或是不使用cleanup的話，就是要進行第二個限制酶時，外加NaCl的濃度進去。若客戶想要混在一起用並延長digest反應時間O/N並不會增加酵素活性，因為鹽分濃度不對，酵素活性也不會增加。buffer中含Tris-HCl、MgCl2、NaCl、KCl、DTT(為抗氧化劑，可穩定含sulfhydryl groups的酵素及蛋白質)。
buffer提供限制酵素作用最佳的pH值及離子濃度，不同的限制酵素的最佳作用條件並不相同，故要使用不同的buffer，且進行限制酵素處理時，若使用buffer不當，會有star activity，而star activity是指限制酵素對所作用的DNA及序列失去專一性，當酵素辨認切割位置的能力降低，導致相似的序列或是錯誤的辨認序列長度也會作用，而產生錯誤的結果。所以當DNA同時以兩種限制酵素處理時，選擇可使兩種酵素之活性反應均可達75﹪以上的restriction buffer，若找不到適當的buffer則先加低鹽的buffer使其中一酵素作用後，在加入高鹽buffer使另一酵素作用，若無法以鹽的高低分別加入不同的buffer，則先加入一種buffer作用後，加3M NaOAc/95﹪alcohol沉澱DNA，再加另一種buffer作用。

Buffer提供限制酵素作用最佳的pH值即離子濃度，不同的限制酵素的最佳作用條件並不相同，因此需使用不同種類的buffer。

回覆:

建議使用產品附的resuspension buffer回溶Trypsin/Lys-C Mix 至濃度1μg/μl(或以下),以25:1 protein:protease ratio(w/w) 使用。
2種步驟standard in-solution protein digestion 與two-step in-solution protein digestion 開始之前要不要做reduction and alkylation都可以, in-gel protein digestion 是需要做reduction and alkylation步驟。

回覆:

Nano-Glo® Live Cell Substrate是保存在 -20℃直到保存期限為止,
如果與Nano-Glo® LCS Dilution Buffer配成Nano-Glo® Live Cell Reagent後,
1.存放20℃, 3小時後,會損失10%的活性,
2.存放4℃,7小時後,會損失10%的活性,

建議現配現用,protocol是不建議在配成Nano-Glo® Live Cell Reagent後,在任何溫度下長時間保存。

回覆:

不需要做cell titer or viability實驗,產品中含有Nano-Glo® Live Cell Reagent,目的是來做normalize,可以降低well to well之間，因為轉染效率或細胞數目所造成的結果差異,因此不需要額外做cell titer的實驗。

RNA用傳統法抽，無論有無gDNA汙染，都會用Dnase I treatment，但treat完後跑膠會有smear問題，想問後續加Rnase inhibitor是否會互相干擾? 樣本是藻類，下游要做NGS，不翻cDNA，要做RNA-seq.

回覆:
經查詢protocol後，有建議若是用傳統方法抽RNA，則可以省略RQ1的第三與第四步驟，也就是不需加stop buffer以及加熱去inactiveDNase，因為reation buffer有鹽類，加上前處理是用Trizol傳統方法抽取RNA，若做步驟3的話，isopropanol可能會和Kit內的stop buffer作用，在膠上就會有smear。若客戶下游是要做RT(看使用的廠牌)有denature at 65 degrees, 那它就會inactivate DNase! 同時也有客戶會在DNase treatment 後再做ㄧ步re-purification step.

回覆:

可適用的儀器與軟體版本如下顯示
• BioRad CFX96 Touch™ Real-Time PCR detection system/
• Thermo QuantStudio 5, 6 and 12 systems
• ABI 7500/7500 Fast Real Time Systems (software 2.0.6 or later)

回覆:

使用G-418的時機通常是為了要建立stable cell line，要看您的用途或是使用的細胞株，因為G-418的濃度會因細胞種類而有所不同。

配法的部分，首先須先知道這個產品Properties Specific to V7983:
• Appearance: White powder.
• Hydration Waters: 0–6, as determined from Elemental Analysis.
• Potency: ≥700μg/mg. Which means if you weigh out 1mg of dry G-418, only 700ug of which is active material.

一般都會先配成濃度較高的stock solution，例如50 mg/ml stock solution，然後再依照work concentration來取用。G-418可溶於PBS，HEPES或是ddH2O中，融解後要用0.22 um的filter過濾，並保存在避光管中，可放在4 or-20度冰箱。

50mg/ml stock solution
假設是要配置 500 mg/ml G-418，考慮到Potency，算法就會是1000/700(Potency)x500 mg/ml=714.29 mg/ml，實際濃度是根據每批lot會有所出入。

回覆:

Na3VO4 treated control 是為了確認Pgp ATPase 活性，Na3VO4為Pgp ATPase抑制劑，與NT control相比，可得到basal Pgp ATPase Activity。理論上RLU(Na3VO4) 及 RLU(NT)會很相近，計算方式是RLU(Na3VO4) – RLU(NT) = ΔRLU(basal)ΔRLU(basal)是冷光相對值，計算結果不管正負值都為合理，影響Pgp ATPase 活性的可能原因有: 1)不同批的Pgp ATPase活性皆有差異，較低的Pgp ATPase活性會的到較低的ΔRLU(basal)，可增加Pgp ATPase assay incubation的時間，從原本的40分鐘，延長至80 or 120分鐘。

回覆:
Reconstituted reagent在室溫下~24小時 or 4度C存放7天，不會影響試劑效能。 Reconstituted reagent較不穩定，不適合保存在-20度C，建議每次配置一次使用的試劑量。

回覆:
caspase-glo 1 試劑的成份中有比較高濃度的DTT，若是接著Reatime-glo以後作偵測會有背景值過高的問題，所以在操作上需要進行optimize，有以下2種方式可以選擇:
1.Fellow Reatime-glo的at dosing and at seeding protocol操作，先進行realtime偵測cell viability，接著在最後一個時間點時，加入multiplex stabilizer後再加入Caspase-glo 1。

2.Fellow Reatime-glo的at dosing and at seeding protocol操作，先進行realtime偵測cell viability，再偵測前caspase-glo1 前，先移除含有Reatime-glo的media，進行一次wash後，加入caspase-glo 1偵測。這個方式僅適用於貼附型的細胞，如果做不好的話，結果的變異性會很大!

回覆:
以一般用途而言，多數會選擇基本款 Riboprobe® System會得到run-off
transcripts，因此不需要外加terminator sequence。但P1300 RNA產量低的話，可以降溫到30度C試試看，若要外加terminatorr sequence的話，還是要based on RNA polymerase，使其template在作用到200bp處停下來transcription後，掉下來(請想像一下)，並再找一段新的template繼續製造，因此建議加terminator sequence及適用的RNA Polymerase再做做看。

回覆:
Glucose Uptake-Glo assay在不同的plate format用量表就如產品protocol 中所寫，步驟如下:
1.Customer should plate varying cell numbers to determine ideal readout for their application. Please include appropriate assay controls. 
2.Plate X number of cells at 100µl per well (of a 96-well plate) and grow overnight.
3.Remove medium from each well and wash with 100µl of PBS.
4.Add 50µl of 1mM 2DG in PBS to each well and incubate for 10 minutes at room temperature.
5.Add 25μl Stop Buffer to each well and mix briefly.
6.Each well now has a total volume of 75μl. Transfer 10μl into a separate 96-well plate (for CellTiter-Glo assay to measure cell viability).
7.To the remaining 65μl, add 25μl Neutralization Buffer and mix briefly.
8.Add 100μl 2DG6P Detection Reagent and mix briefly. Incubate for 1 hour at 25°C.
9.Record luminescence with 0.3–1 second integration on a luminometer.
10.In the separate 96-well plate with 10μl sample from Step 6, add 200μl CellTiter-Glo® Reagent (Cat.# G9241) and mix briefly. Incubate for 10 minutes at 25°C.
11.Record luminescence with 0.3–1 second integration on a luminometer.