【勁報第45期｜HiBiT活細胞蛋白標記系統】

HiBiT Protein Tagging System

HiBiT活細胞蛋白標記系統具有靈敏、Antibody-free與易於操作之特性，僅需一般冷光儀，即能定量細胞Endogenous或Overexpression蛋白質的變化，HiBiT技術為蛋白質生物學領域的研究人員開闢了無限的可能性。HiBiT是以NanoBIT技術為基礎，研發出具有多功能性的蛋白標記物，核心技術為利用表現 HiBiT-tagged(HiBiT:11 a.a)的目標融合蛋白，與其具有高親和力(KD = 700 pM)互補胜肽的Large BT(LeBiT)結合，並加入檢測試劑使其產生冷光，能用來偵測與定量蛋白質表現的程度。

特色與優勢  

以偵測GPCR的Trafficking-Internalization與Recycling為例與ELISA Method相比，HiBiT Method提供更靈敏、操作更便利。

Small Tag Size
■減少對於目標蛋白的影響 
■適用於CRISPR/Cas9(Genomic knock-in)技術

Simple & short detection protocol
■一步驟(“Add only”)均質系統
■無須抗體與Wash步驟
■亦適用於高通量分析

Sensitive & Quantitative
■高靈敏性(Sub-attomole)，亦適合偵測內源性蛋白
■廣泛的線性檢測範圍(>7-logs)

Facilitates Endogenous protein assays with CRISPR/Cas9
■無需Cloning
■研究內源性蛋白質量的變化
■提供進行優化過的實驗步驟資訊


 

HiBiT Tagging & Quantifiction Workflow

NanoBiT表現HiBiT-Tagged融合蛋白有兩種方式：

使用轉染載體DNA方式，使目標細胞表現外源性HiBiT-Tagged融合蛋白(Overexpression)
►Promega提供Multiple cloning site(MCS) or Flexi 兩種形式的Vector供客戶選擇。

使用CRISPR/Cas9方式，使目標細胞表現內源性HiBiT-Tagged融合蛋白(Endogenous)
►將HiBiT Tag序列插入細胞中目標基因，表現內源性HiBiT-Tagged融合目標蛋白~Cloning-free protocol for rapid success!  

HiBiT Protein Tagging System技術的四種檢測方式     
    

1.Nano-Glo HiBiT Lytic Detection System(偵測總量蛋白)
此套系統為利用表現HiBiT-Tagged的目標蛋白，其試劑會將細胞裂解，並加入舉友與HiBiT高親和力互補胜肽的LgBiT做結合，並加入Furimazine substrate檢測試劑使其產生冷光，用來偵測與定量細胞表現的總蛋白量。

2.Nano-Glo HiBiT Extracellular Detection System(偵測細胞膜上或培養基中蛋白)
此套系統為利用表現HiBiT-Tagged的目標蛋白，其試劑不會將細胞裂解，並加入具有與 HiBiT高親和力互補胜肽的LgBiT做結合，並加入Furimazine substrate檢測試劑使其產生冷光，用來偵測與定量表現在細胞膜上或培養基中分泌型的蛋白。

3.Nano-Glo HiBiT Blotting System(無須抗體偵測蛋白分子大小與表現量)
此套系統能取代傳統Western blot方法，分析包括蛋白分子大小與表現量，省去傳統Western blot的Washinf與Blotting步驟，縮短實驗時間至數分鐘，專一性高，無Non-specific背景雜訊，Antibody free，無抗體專一性及批次差異問題，可降低實驗成本。 

4.LgBiT Expression Vector and Stable Cell Line(長時間偵測活細胞內蛋白量)
利用LgBiT Expression Vector建立能穩定表現LgBiT的Stable cell line，抑或是直接購買 HEK293 LgBiT Cell Line，再將目標蛋白以轉染載體或CRISPR/Cas9方式在細胞內已Transiently，Stably或 Endogenously方式表現帶有HiBiT Tag的目標融合蛋白，此時HiBiT會與LgBiT做結合，並加入短效或長效型的Furimazine substrate檢測試劑使其產生冷光，能長時間(Kinetic)偵測細胞內目標蛋白的變化。

Applications of the HiBiT Protein Tagging System

HiBiT Protein Tagging System為研究基因與蛋白功能性領域的研究人員開啟無限可能性。利用HiBiT，一種極小的冷光蛋白標籤，搭配優化後的實驗條件與試劑，讓您輕鬆建立符合各種實驗需求的蛋白質應用。

 想知道各種應用的詳細資訊請參考最新發行的： 

一、蛋白穩定度分析(Protein Stability Sensors)
訊息傳遞的調控與許多疾病息息相關,藉由偵測與疾病相關的訊息傳遞路徑之蛋白質穩定度 (Increasing/Decreasing),能深入探討疾病發生的作用機制。接下來以HIFIQ蛋白為例,使用Nano-Glo® HIBIT Lytic Detection System偵測HeLa細胞在缺氧(Hypoxia)環境下,HIFla蛋白量的變化。
Stabilization of transcription factor HIFla
缺氧誘導因子HFla,主要參與細胞產生一系列於缺氧環境的調控,對於生物體的生長發 育、生理與病理過程中發揮重要作用。 HIFIa的訊息傳遞路徑是藉由泛素與蛋白酶體(Ubiquitin Proteasome)調控,細胞在含氧量正常的條件下,HIFla透過Proly Hydroxylation,使其能被 Von Hippel-Lindau (VHL)泛素連接酶辨識並泛素化,爾後透過蛋白酶體使其被快速降解。在缺氧的環 境下, Proly Hydroxylation被抑制,導致HIFI蛋白無法VHL結合,而堆積在細胞核內。 

二、偵測蛋白質降解的程度(Monitoring Target Protein Degradation)
蛋白質的降解與改變訊息傳遞路徑息息相關,常見使用RNA敲除蛋白基因或化學抑制劑,來 抑制蛋白分子活性,但有其缺點,例如小分子藥物會出現耐藥性,無法長期抑制目標蛋白的活 性;RNAi有脱靶效應等缺點,因此蛋白降解靶向嵌合體-PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)小 分子藥物技術成為藥理學上干擾訊息傳遞的一種新策略。
PROTACs – Targeting Proteins for Degradation
PROTAC利用細胞自身的蛋白質破壞機制來從細胞中去除特定致癌蛋白,是一種靶向治療的 替代方法。技術原理主要是利用嵌合體分子將目標蛋白和E3 Ligase通過化學鍵連接起來,把目 標蛋白降解。嵌合體分子包括三部分:一端是連接目標蛋白的結構,另一端是連接招募蛋白降 解物例如E3 Ligase的結構;中間通過合適的Linker連接,形成Protein of Interest(POI-PROTAC-E3 ligase三元複合物,當三元複合物形成,便可瞬時完成目標蛋白的泛素化,且PROTAC在細胞內 可多次循環作用。

三、定量細胞表面受體與內化(Surface Receptor Quantification & Internalization)
Nano-Glo® HiBit Extracellular Detection System 相較於使用傳統Antibody-based 方法 , 擁有操作簡單，省時與降低Well-to-Well實驗數據差距之特性，能快速定量細胞表面受體與內化的變化。
B-2 adrenergic receptor (ADRB2) Internalization
使用不同的Agonists誘導 B-2 adrenergic receptor (ADRB2)發生受體內化，當細胞表現帶有Externally-tagged HiBiT ADRB2的融合蛋白，使用Nano Glo® HiBiT Extracellular Detection System偵測，Externally-tagged HiBiT會與試劑裡的LgBiT結合，加入偵測試劑後，發出冷光訊號，當HiBiT-tag ADRB2融合蛋白發生受體內化，由於LgBiT不會滲透到細胞內，使得HiBiT與LgBiT無法結合，因此冷光訊號下降，藉此定量ADRB2受體內化的情形。

四、偵測細胞自體吞噬的活性(Autophagy Assay) 
細胞自噬是人體細胞中一個重要的機制,細胞會自己清除有害物質,讓細胞維持正常運作的 一個作用。通過檢測LC3蛋白的變化量,能觀察細胞自噬(Autophagic flux)的程度,Autophagy LC3 HiBIT Reporter Assay系統是以冷光為基礎,提供一個均質、盤式讀取,能偵測活化或抑制細 胞自噬路徑的工具。
Process of LC3 degradation during autophagy

細胞接受自噬誘導信號後,細胞內的LC3蛋白質和脂質(Phosphatidylethanolamine, PE) 先形成 彎月狀的雙層膜構造,稱為吞噬泡(Phagophore),吞噬泡泡會藉由增加新的膜逐漸增大,並且將 受損的細胞器或蛋白質包圍,最後凹陷端逐漸封閉成為囊狀構造的自噬體(Autophagosome),自噬體的外層膜會與溶酶體(Lysosome)的膜靠攏,並與之融合形成「自溶酶體」(Autolysosome), 藉由溶酶體內水解酵素分解老舊細胞器或蛋白質成小分子物質,其中小分子物質如胺基酸則可 以再回收利用成為材料,完成細胞自噬作用。其中PP242為Autophagy的誘導劑,Bafilomycin A1為抑制劑。

五、偵測病毒的感染與病毒的釋放(Monitor Viral Infection and Viral Release)
由於HiBiT很小，僅11個Amino acid，非常適用於病毒釋放與感染細胞的相關研究，相較於傳統ELISA實驗，HiBiT操作步驟簡單，只需"加、混、測"，去除加抗體與繁瑣的Wash步驟，其高靈敏的特性，能偵測低表現量的蛋白。

六、偵測分泌型蛋白(Quantify HiBiT-tagged proteins expressed on secreted/total from cell)

Nano-Glo@ HiBiT Extracellular Detection系統能用來偵測與定量表現在細胞膜上或培養基中分泌型的蛋白，利用表現HiBiT-tagged的目標蛋白，試劑不會將細胞裂解，並加入具有與HiBiT高親和力互補胜肽的LgBiT做結合，再加入Furimazine substrate檢測試劑使其產生冷光，也可搭配Nano-Glo@ HiBiT Lytic Detection系統，來偵測與定量細胞表現的總量蛋白。

七、活體冷光(In vivo Imaging in Animal Model)

利用HiBiT與LgBiT結合產生冷光的特色，透過基因工程讓病毒表現HiBiT，並將表現LgBiT蛋白的細胞株，注射移植到動物體内，經過培養後再將表現HiBiT的病毒注射到動物腫瘤位置，再注射Substrate產生冷光。

結語

Protein Reporter是Promega近年來積極開發的方向，利用冷光方式取代傳統低靈敏度及高背景質的吸收光或是螢光，且在許多蛋白研究領域都有可以應用產品，HiBiT Protein Tagging System能滿足您多種蛋白相關實驗的需求。