【勁報第46期｜HaloTag® Technology】

HaloTag® Technology是一種讓您研究蛋白質功能的平台，完全相容於In vivo或In vitro的實驗，帶有HaloTag®的融合蛋白能與HaloTag® ligand形成強韌的共價鍵結，能有效標定您的蛋白，可搭配多樣化的Functional group，相容於後續多種實驗。

使用HaloTag^®能做那些應用呢?

除了用於蛋白質純化，HaloTag對於蛋白質研究彈性高且應用廣泛，不必改變Tag或重新選殖，只要運用不同功能基(Functional group)，如螢光及其他反應HaloTag@Ligands(配體)，形成專一性共價鍵結合，也能夠應用於細胞及生化相關之實驗，包含蛋白/蛋白間交互作用，蛋白/DNA間交互作用、活細胞影像觀察蛋白分佈、定位、追蹤及新舊合成、偵測目標蛋白降解程度、藥物篩選(Target ldentification)等多功能研究，簡單來說,有了"HaloTag@ Technology"，一次搞定您的實驗！

HaloTag^®可以協助進行那些實驗呢?

一、蛋白純化(Protein Purification)

Purify soluble protein from E. coli or Mammalian cells,表達和純化蛋白質,是了解蛋白質功能的基本方式。

二、蛋白定位、追蹤及代謝(HaloTag for Fluorescent Imaging)

搭配適當的HaloTagLigand,用於標定您的目標蛋白,以達成定位、追蹤等目的!Promega開發多種相對應的Ligand。

結構上,HaloTag Ligand包含二種重要組成,分別為反應臂(HaloTag Reactive linker)與螢光標定或親和性質的高能分子基團(Fuctiongoup)(如下圖),一般生理條件下,HaloTag protein與Ligand的共價結合率極佳(甚至優於Biotin與Streptavidin),專一且不可逆,無需擔心其他化學干擾問題。HaloTagLigand能根據實驗目的,選擇適當的Ligand標記方式,操作方式十分彈性。

三、蛋白交互作用分析(HaloTagMammalianPull-DownSystem)

HaloTag Mammalian Pull-Down System可用來分離與鑑定哺乳細胞中蛋白複合物(Protein complexes),HaloTag融合蛋白會與Haloink Rein形成具有高專一性的共價鍵,減少非特異性結合,不論是內源性(Endogenous)蛋白或表現量低的蛋白,皆可快速、有效率捕獲哺乳動物細胞中,相互作用的蛋白質,而HaloTag Mammalian Pull-Down and Labeling System,試劑包含HaloTag TMRDiect Ligand,可用來偵測蛋白質表現量與優化蛋白質表現條件等應用。

四、活細胞蛋白交互作用動態分析(NanoLuc" Bioluminescence Resonance Energy Transfer / NanoBRET)

NanoBRET活細胞PPI分析系統為改良版的冷光共振能量轉移(BRET系統),使用史上最亮Nanoluc luciferase(比Rluc亮高達15倍)做為能量的供體(Donor),並以HaloTag接上NanoBRET618螢光基團,作為能量受體(Acceptor)來測量特定蛋白質之間相互作用,當兩蛋白間距離夠近(<10 nm) ,NanoLuc Luciferase激發NanoBRET618螢光基團產生BRET訊號。

五、HaloTag技術與染色質免疫沉澱技術的完美結合(HaloCHIP System)

染色質免疫沉澱技術用於分析蛋白質在Chromtin上的結合位,但現有技術存在需高專一性抗體、Co-IP抓取效率與專一性、步驟繁複及耗費時間等缺點。HaloChip System利用獨特的HaloTag技術,不需使用抗體,即可共價抓取在細胞內的Protein:DNAcomplex(如下圖)。
先將有興趣的蛋白質,在細胞中表現為HaloTag fusion protein,以Formaldehyde cross-link胞内的Protein:DNA,裂解細胞後,將Chromatin sonication處理為500~1500 bp片段,之後加入HaloLink Resin抓 HaloTag fusion protein:DNA complex,洗去非專一結合物後,還原Protein:DNA的Cross link,最後純化DNA片段序列。

六、偵測蛋白降解表型(Targeted Degradation of HaloTag Fusion Proteins)

想了解蛋白質在細胞內的功能,通常會使用CRISRP方式或是RNAi knockdown想要研究的目標蛋白基因。這些方法面臨的挑戰,包括目標蛋白的功能缺失,或是該蛋白缺失會導致細胞死亡或停止生長等。為了克服這些障礙,一種由耶魯大學Craig Crews教授開發的小分子藥物HaloPROTAC3,能將細胞内帶有HaloTag標籤目標融和蛋白降解,進一步觀察,對於細胞生理或代謝的影響,也可應用在找尋PROTAC標的上。除了HaloPROTAC3,Promega近期推出ent-HaloPROTAC3,做為負控制組,可用來確認HaloTag融合蛋白降解是經由VHL engagement與PROTAC的機制。

七、藥物盟未知蛋白交互作用(Target ID ~ Explore Small Molecule Interactors)

Promega Target ID是以HaloTag為基礎,開發用來篩選藥物-未知蛋白交互作用的平台。

八、偵測抗體抑制蛋白交互作用NanBRET624 CBT Protein Labeling

NanoBRET 624 CBT Protein Labeling是以HaloTag技術為基礎,可同時將蛋白純化與螢光標記,下游能用來評估抗體阻斷目標Receptor與Labeled Ligand之間交互作用的效力。