【勁報第42期｜microRNA & Protein Degradation轉錄/轉譯調控】

 miRNA：又小又重要的基因調控元素 

 MicroRNA(miRNA) 是一群小的(約18-24個核苷酸)單鏈非編碼RNA(single-stranded, Non-coding RNAs)，它們在基因表達中具有負調控的作用。
 

2. 研究表明，癌細胞釋放的特定外泌體miRNA可以與周圍細胞中的受體結合，並影響腫瘤微環境。
3. 許多miRNA已顯示在幾種癌症中被Downregulated，包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌和神經膠質瘤。miRNA的抑制與癌症的發展及耐藥性(Drug resistance)有關，並參與調節腫瘤的生長和血管生成。


一、分析miRNA的五大步驟
1.Sample selection:
♦從各種樣品類型中提取RNA。多數從細胞和組織中，可提取高質量的miRNA。
♦FFPE組織也可以抽取可用的miRNA。
♦顯微解剖方法(Microdissection)或其他靶向細胞(Cell-targeting)的方法。
♦血漿中分離miRNA則較具挑戰性。

2. RNA Extraction

 

3. RNA QC Quantitation

由於大多數分析方法都使用Total RNA，一般無需對提取RNA中存在的miRNA數量進行定量。Tewari, M et al. (2015) MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358–369. 
Promega也有相對應的產品為: QuantiFluor® RNA System Cat#E1330).

4.RNA Profiling Methods/Application
►RT-qPCR:qRT-PCR目前以Absolute miRNA定量最為常見因具有最大的靈敏度和動態範圍。
►Microarrays:於miRNA上會標記螢光核苷酸，然後雜交以捕獲位於Slides或Beads上的探針，雜交後，檢測螢光看是否有miRNA。
►RNAseq:RNAseq涉及使用RNA樣品製備cDNA Library，一次對數百萬個cDNA分子進行大規模平行定序(Massively parallel sequencing)。
►Reporter Assays(miRNA activity):Luminescent reporter system方式，可讓研究者用於檢測細胞中特定miRNA對於Target sequence的活性。



提供使用者兩個專門用於RNA interference study的Vector: pmir-Glo以及pmirNanoGlo.
         

5.Data Analysis: 須依據實驗目標、需求找到適合的分析平台。
 

蛋白質摺疊有關的疾病(Protein folding-related diseases)

一、 發掘蛋白質降解(Protein degradation)的秘密
常見蛋白質摺疊錯誤堆積為神經退化方面的疾病，會對細胞造成傷害，泛素-蛋白酶體系統負責清理細胞中摺疊錯誤或有害的蛋白，通過活化此系統，能特異性的清理致癌蛋白。

1.抗癌藥物的新趨勢：誘導蛋白降解:許多癌症標靶新藥都是針對致癌蛋白作用，這些小分子藥物通常是結合在致癌蛋白的活化位置抑制其活性。

2.蛋白死亡之吻-泛素(Ubiquitin)與泛素化(Ubiquitination)的發現:
•泛素蛋白(Ubiquitin)是由76個胺基酸殘基所組成,分子量約8.5kDa,以「泛素」為名是因為它在真核生物(原核細胞中尚未發現)體中廣泛存在,具有高度保守的序列,並且存在於所有已知的真核生物體中。
•泛素化(Ubiquitination)是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細胞內的蛋白質分類,從中選出目標蛋白分子,對目標蛋白進行特異性修飾的過程,形成目標蛋白多聚泛素鏈。
這些特殊的酶包括泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)、泛素連結酶(E3)等。
•泛素化過程是可逆的，泛素可被去泛素化酶(Deubiquitinase, DUB)從泛素鏈上去除，形成反向調節。

3.誘導蛋白降解(Induced protein degradation):




二、蛋白質穩定度冷光分析
Protein Stability Sensors Based on NanoLuc® Luciferase蛋白穩定度分析



Promega提供幾種Ready-to-use的 NanoLuc® stability sensors Plasmid (hypoxia, oxidative stress與p53)供客戶選用。

 

三、蛋白質降解度分析
您有想要降解的蛋白嗎? 有了它~降解蛋白不再是問題- HaloPROTAC-3



使用HaloPROTAC-3能將細胞內目標蛋白降解，來進一步觀察對於細胞生理或代謝的影響，也可以應用在找尋PROTAC標的蛋白質上。


 其作用原理: 
HaloPROTAC-3一端會去辨認帶有HaloTag的融合蛋白，一端會去辨認VHL E3 Ligase，此時目標蛋白會被帶到Proteasome進一步降解。

四、研究PROTAC最佳拍檔- NanoBRET®, NanoBRET® TE, HiBiT Technology
The Protein Slayers淺談蛋白降解靶向嵌合體(PROTAC)技術:
PROTAC(Proteolysis Targeting Chimera)是始於2001年的一項技術,該技術利用了細胞內的「清潔工」—泛素-蛋白酶體系統(Ubiquitin-proteasome system, UPS)。泛素-蛋白酶體系統正常生理功能負責清理細胞中變性、變異或者有害的蛋白。

使用NanoBRET®, NanoBRET® TE與HiBiT 等技術於PROTAC之五大應用:

►應用一: Monitoring Target Protein Degradation-確認蛋白質降解的程度



►應用二: Monitoring PROTAC Permeability and Target Engagement-偵測PROTAC的滲透性與目標物親和性




►應用三: Monitoring E3 Ternary Complex Formation-偵測POI-PROTAC-E3 ligase三元複合物的形成



►應用四: Monitoring Ubiquitination-偵測POI泛素化程度




►應用五: Monitoring Translocation to Proteasome-偵測目標蛋白與蛋白酶體的交互作用




結語:
蛋白降解藥物最有吸引力的地方在於它可以針對那些傳統上認為不可成藥(Undruggables)的目標致癌蛋白,這些蛋白約占了全人類蛋白質種類的85%以上,這些蛋白既不是酶(Enzymes)也不是受體(Receptors),缺乏小分子抑制劑能結合的位置,導致小分子抑制劑無法抑制目標蛋白質活性,由於蛋白降解藥物的降解策略,是可以通過結合蛋白上的任何一個位點,而不是活性位點,來達到降解蛋白的目的,因此有適用於任何蛋白質的潛力。另一個優勢是可以對那些已經產生抗藥性的腫瘤發揮作用。蛋白降解藥物除了應用在癌症外,在其它疾病中也是具有相當大的潛能。

五大應用圖說: