T Cell Activation Bioassays

T Cell Activation Bioassays

當前的免疫細胞療法策略主要有三大方向: 抑制、增強或將T細胞改造。對於癌症及自體免疫等不同的疾病特性，必須先了解其致病的機制及免疫細胞的作用方式，才能設計出有效且正確的治療策略。

T細胞的活化主要是通過細胞表面的TCR/CD3 complex以及Co-stimulatory receptor CD28來啟動，TCR/CD3 complex下游的信息傳遞途徑為NFAT pathway；而TCR/CD3 complex + CD28則是與IL-2 production相關，參與的信息傳遞途徑包括NFAT、AP-1及NF-κB pathways。

Promega設計出兩種T Cell Activation Bioassay: NFAT及IL-2，都是基於冷光Reporter cell-based assays技術來開發，提供Reporter TCR/CD3 Effector Cells (NFAT or IL-2)兩種模式:

Engineered Jurkat T reporter cell line，由NFAT-response element (NFAT-RE)或IL-2 promoter來控制冷光Reporter gene的表現。(左)當TCR/CD3 Effector Cells (NFAT)與適當的TCR/CD3 ligand或anti-TCR/CD3 antibody結合(E.g. MHC II)，TCR就會傳遞細胞內信號，啟動NFAT-RE來表現冷光；同樣的，(右)當TCR/CD3 Effector Cells (IL-2)與Anti-TCR/CD3及Anti-CD28的刺激有Co-engaged(E.g. MHC II & CD80/86)，就可啟動IL-2 promoter來表現冷光。

• Bispecific antibodies應用-(CD3 × CD19 BiTE) 

    當TCR/CD3 Effector Cells (NFAT)與TCR/CD3 ligand或是Anti-TCR/CD3抗體結合，就可活化TCR pathway並經由NFAT-RE表現出冷光。

• Blockade of CD28:CD80/86 應用

Abatacept (CTLA-Fc recombinant protein) 藉由CTLA-4與aAPC表面的CD80/CD86作用來阻斷其與CD28的結合，達到抑制IL-2 promoter活化的效果，使冷光表現下降。

• CAR-T 應用

TCR/CD3 (NFAT or IL-2) effector cells藉由瞬時轉染(Transient transfection)表現Chimeric antigen receptor(CAR)。

TCRαβ Knock-Out T Cell Activation Bioassays 

專為Transgenic TCRs應用所設計的Reporter Bioassay，針對TCR-T的活化檢測方式，傳統上仰賴複雜且費時的步驟來完成，其結果重複性低，對於研究人員一直是很大的挑戰，而Promega TCRαβ-KO Bioassay可在方法上克服現有方式的侷限，讓研究人員可以更容易且準確的對Transgenic TCRs進行功能性的測試，篩選出對於特定抗原的專一性及效力，並可用於安全性試驗的開發。

T Cell Activation Bioassay (TCRαβ-KO)是使用Promega最新的NanoLuc® luciferase來開發，由穩定的冷光Reporter細胞株組成，建構於Jurkat T細胞，並用CRISPR/Cas9的方式將內源性TCR的表現剃除(TCRαβ-KO)，研發人員利用此細胞株進行檢測時就可不受到內源性TCR的干擾，並藉由靈敏的冷光訊號來測量Transgenic TCRs的活性，其應用包括:

• CAR-T cell receptors的活性檢測方式
• 檢測Antigens的活性以及專一性
• 確認Bispecific antibody的效力及穩定性

• 特色與優勢
  • 品質符合ICH guidelines: Precision、Accuracy以及Linearity的標準要求。
  • 簡單的操作流程，降低技術上的限制。
  • 適用於抗體篩選及藥物開發應用。
  • 高通量形式，可進行96-well以及384-well plate formats。

• 細胞設計: ​T Cell Activation Bioassay (TCRαβ-KO)有三種TCRαβ-KO細胞:
  • TCRαβ-KO Cell Line (CD4⁺)
  • TCRαβ-KO Cell Line (CD8⁺)
  • TCRαβ-KO Cell Line (CD4⁺/CD8⁺)

皆以Cell propagation model和Cell Bank兩種形式提供，搭配Bio-Glo-NL™ Luciferase Assay System冷光檢測試劑。

Endogenous TCR(αβ)與Transgenic TCR(αβ)會產生多種組合模式(Mismatched)，降低Transgenic TCR(αβ)的比例，導致在Transgenic TCR(αβ)功能性檢測的結果上較難看出差異。將Endogenous TCR(αβ)剔除的TCRαβ-KO細胞，可使Transgenic TCR(αβ)單一的表現，並在功能性檢測時看出差異更大的結果。

T Cell Dependent Cellular Cytotoxicity (TDCC) Bioassays

CD8⁺ T Effector cells與有表現目標抗原(Tumor-associated antigen)的HiBiT Target cell共同培養，加入抗體後，產生 TDCC活性，促使CD8⁺ T Effector cells將HiBiT Target cell毒殺，HiBiT Target cell裂解後釋放出HaloTag- HiBiT protein，就可使用HiBiT detection system來做冷光偵測。

• 特色與優勢
  • TDCC-qualified CD8⁺ T cell，經過原廠TDCC活性驗證。
  • 使用HiBiT Target cells，可得到專一的細胞死亡結果。
  • 靈敏度高、均質化的冷光檢測系統，提供良好的Assay window。
  • 搭配不同的HiBiT detection system，適用Endpoint or Kinetic formats。
  • “Thaw-and-use”的設計，提升實驗便利性及再現性。
  • HiBiT Target cells包含HaloTag® Technology可延伸應用於各種Downstream assay:
    • Cell sorting
    • FACS
    • Fluorescent imaging-based assays

• CD3xTAA Bispecific Molecules檢測