【勁報第47期｜Real-Time Assay~It's a New Concept】

Live-cell kinetic assay，也稱做Real-time assay，不像一般的End-point assay只能在一個Sample中得到一個時間點的Data，Real-time assay可以將一個Sample的實驗價值最大化，對於時間點密集的實驗設計，更是大大提升了操作上的便利性。

If used Real-time assay,you could...

• No More Missing Time Points：同一盤細胞，在多個時間點重複收集Data，解決抓不到時間條件的窘境。
• Lower Variation, More Real：減少培養細胞的操作、數量以及培養過程中造成的CV%，大大增加結果一致性及可信度。
• Less Cost：減少細胞培養耗材、試劑使用量、勞力及時間。
• Save Precious Samples：細胞樣本使用最大化，非裂解的操作方式可相容其他Assay做多功分析，提高Data完整性。

Promega Real-time assay產品線齊全，涵蓋各種用於Cell biology及Protein study的試劑，操作方式主要有兩種：

Workflow#1:Repeated Reading from Same Well-加混測做法

只需要在細胞盤中加一次試劑，就可在各時間點重複讀盤，此作法可應用於：

• Cell Viability assays
• Protein：Protein Interactions assays
• Cytotoxicity assays
• Reporter Expression assays
• Apoptosis assays
• Targeted Protein Degradation assays
• Extracellular ATP assays
• Target Engagement assays

Workflow#2:Repeated Sampling from Same Well-取樣做法

在規劃好的時間點，從同一細胞盤中重複取樣少量的Cell media，與試劑混合後即可做偵測，此作法可應用於：

• LDH Release assays
• Energy Metabolism assays
• Lipid Metabolism assays

可在一盤細胞樣本中實現Real-time及Multiplex的分析結果，並在一次的實驗結果中蒐集大量的數據，觀察完整的Apoptosis event。

Real-time multiplex Assay Applications：

• Apoptosis and Necrosis
• Metabolic Phenotype
• Cell Viability and Cytotoxicity
• High Throughputs Drug Screenings

以Workflow#1"加混測做法"，依不同規格的儀器可有不同的讀盤方式：

1. 使用可控制氣體參數調節的盤勢讀取儀
2. 使用無氣體參數調解但可控制溫度的加熱式盤式讀取儀，並使用CO2-independent medium來培養細胞。
3. 使用一般規格培養箱和盤式讀取儀在各實驗時間點手動讀盤，收集數據。

以Workflow#2"取樣做法"，則是先將不同時間點的取樣與試劑混合後，在進行上機讀盤，可適用以上所有儀器規格。
GloMax^®Detection Systems

GloMax®盤式讀取儀系列，共有三種機型-GloMax®、Navigator、Explorer及Discover，操作軟體內建Promega產品操作步驟，可用於上述的Workflow#1-2、1-3及Workflow#2的做法。

• 可用6~384well
• 含Tablet PC
• 可溫控至45ºC
• 具震盪器
• 可選購兩支自動分注器

RealTime-Glo^TM MT Cell Viability Assay / Workflow#1 
Workflow#1加混測的做法，72小時不間斷，檢測細胞Reducing potential變化。




LDH-Glo^TM Cytotoxicity Assay / Workflow#2 
Workflow#2取樣做法，只需在特定時間點取樣2-5µl Culture media，即可測量當中的LDH含量，以了解細胞死亡的狀況。

CellTox^TM Green Cytotoxicity Assay / Workflow#1 
具有專利的螢光CellTox^TMGreen Dye，可結合從死細胞釋放出來的DNA片段，並產生綠色螢光(Ex.485nm/Em.510nm)，採用Workflow#1加混測的做法，可72小時連續偵測細胞死亡。




RealTime-Glo^TM Extracellular ATP Assay / Workflow#1 
Extracellular ATP(eATP)專用的Live-Cell Kinetic Assay檢測試劑，主要設計給進行Immunogenic Cell Death(ICD)研究的實驗，可用Workflow#1加混測的做法，連續偵測eATP release長達24小時。




 

RealTime-Glo^TM Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay / Workflow#1 
使用Promega NanoBiT技術，可在活細胞中做48小時動態分析，使用Workflow#1加混測的做法，冷光檢測早期凋亡(PS exposure)，螢光(EX.482/Em.510nm)檢測二級壞死(Dead-cell DNA)。




Energy Metabolite Detection Assays / Workflow#2 
利用Workflow#2取樣做法，可將不同時間點蒐集的 Culture media做稀釋並分別用於各種Energy Metabolite Detection Assays，檢測樣本中Glycolysis及Glutaminolysis改變。




 

 Lipid Metabolism / Workflow#2 
與Energy Metabolite Detection Assays相同，可採用Workflow#2取樣做法，應用在不同時間點收集而來的生物樣本上，檢測其中的Extracellular lipid metabolite含量，來觀察脂肪代謝隨著時間的變化。






 Nano-Glo ^® Endurazine^TM and Vivazine^TM Live Cell Substrates/ Workflow#1 
Promega專利研發，設計出可長時間進行活細胞Reporter assay的兩套冷光系統：Endurazine^TM與Vivazine^TM，只需用Culture medium將此兩種Substrates稀釋後，就可依造Workflow#1加混測的做法，進行長達3天的Live-Cell Kinetic Assay。




NanoBRET^TM Protein：Protein Interaction System / Workflow#1 
NanoBRET^TM為改良版的冷光共振能量轉移(BRET)系統，使用超亮的NanoLuc^® Luciferase(比Rluc亮高達150倍)作為能量的供體(Donor)，並以HaloTag^®接上NanoBRET^TM618螢光基團，作為能量的受體(Receptor)來測量特定蛋白質之間相互作用，當兩蛋白間距離夠近(<10nm)，NanoLuc^® Luciferase激發NanoBRET^TM618螢光基團產生BRET訊號。




NanoBiT^® Protein：Protein Interaction System / Workflow#1 
NanoBiT^®是Promega創新的蛋白互補分析系統，為二元體組成，將原先的NanoBiT^® Luciferase分成兩個極小次單元-SmBit及LgBiT，兩者為低親和性(Low affinity)，能降低非專一性結合(Non-specificity binding)，減少背景值而提升實驗結果的差異度，非常適合用於即時偵測或細胞內蛋白交互作用！將此二元體分別接上兩個目標蛋白，若此二目標蛋白因交互作用而結合，LgBiT及SmBiT即可結合成為具有活性的NanoBiT^® Luciferase，產生冷光訊號。








NanoBRET^TM Target Engagement(TE)&NanoBRET^TM TE Intracellular Kinase Assay / Workflow#1 
利用NanoBRET^TM技術，依據加入Tracer順序的不同，能偵測在活細胞中，待測藥物與目標蛋白之間的親和力與停留時間。原理為轉染NanoLuc^® Luciferase載體到目標細胞，使細胞表現帶有NanoLuc^® Luciferase tag的目標融合蛋白(Fusion protein)，加入帶有螢光基團的Tracer(Fluorescent tracer)，此Tracer會與帶有NanoLuc^® Luciferase tag 的目標蛋白特異性及可逆性(Reversibly)結合，產生BRET訊號，爾後再加入待測藥物與Tracer競爭，隨著待測藥物濃度的增加(Dose-dependent)，Tracer被競爭下來，其BRET訊號也隨之下降，藉此偵測待測藥物與目標蛋白之間的親和力。只需將加入Tracer與藥物的順序對調，即可偵測藥物於目標蛋白的停留時間，藉此評估及排序藥物的效力。