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Live-Cell Protein Interactions
圖一、BRET原理及光譜示意圖
NanoBRET™ Protein-Protein Interaction (PPI)
NanoBRET™為改良版的冷光共振能量轉移(BRET)，使用史上最亮NanoLuc® luciferase做為能量的Donor，並以帶有NanoBRET™618螢光基團，作為能量受體來測量特定蛋白質之間相互作用。大幅改善傳統BRET之Donor與Acceptor放射光光譜重疊的問題，降低背景值，提供最靈敏的分析。NanoBRET™除了可用於偵測活細胞蛋白與蛋白的交互作用，也是篩選影響蛋白與蛋白交互作用的絕佳工具。
NanoBRET™ Protein:Protein Interaction Assays
BRET是什麼?
Bioluminescence Resonance Energy Transfer 冷光共振能量轉移
發生BRET的三個關鍵要素：
1. 存在Donor及Acceptor
2. 其光譜重疊
3. 夠近的距離
圖二、NanoBRET的組成要素
NanoBRETTM的兩大優勢- NanoLuc及HaloTag® NanoBRET™618 Ligand
NanoLuc™冷光酶特色
- 分子量小，僅有19.1KDa
- NanoLuc™冷光酶不須轉譯後修飾，不含雙硫鍵結構
- NanoLuc™冷光酶基因經修飾，冷光超亮超穩定
- 在pH6~8的環境下皆可反應活化
- 可依實驗需求，選擇分泌型NanoLuc™冷光酶
- 熱穩定性佳，Tm=60°C
圖三、不同luciferase放射光譜分布
使用NanoLuc的好處？
- 超激亮－超過100倍的光強度，於哺乳類細胞更亮。訊號易觀察，且適用於難轉染細胞，就算轉染 效 率 差 ， 仍 可 看 到 顯 著 的 差 異 ！ 並 且NanoLuc亮到能呈現於活細胞影像！
- 超級小－ 僅 只 有 19kDa， 比 Firefly及 Renilla luciferase 還小、兩三倍，更比GFP小的多。size越小 tag能夠減少立體障礙現象 (steric hindrance)，大幅降低對於目標蛋白功能的影響。
- 高 解 析 放 射 光 譜 訊 號－ 相 較 於 Firefly及 Renilla luciferase，NanoLuc的放射光譜較為左移 (見圖三)，本產品另一特點則是HaloTag技術，此設計除了讓螢光基團與protein B保持一定距離，將對其功能影響降到最低之外，Acceptor是經過最佳化調整，使HaloTag® NanoBRET™ 618 Ligand放射光譜右移，在不失激發重疊區域的情況下，將其光譜與NanoLuc分得更開，彼此訊號重疊區域大幅減少 (見圖四)。在偵測讀值時更能區分此二種訊號，大幅提升偵測靈敏度 (detection sensitivity) 。
圖四、不同luciferase放射光譜分布
圖五、八種HaloTag® 或NanoLuc® luciferase Fusion之蛋白質表現載體
怎麼開始建立NanoBRET™ PPI Assay?
一、建構與HaloTag®或NanoLuc®luciferase Fusion之蛋白質表現載體
首先需要確認NanoLuc® luciferase及HaloTag®標記在蛋白質的N端還是C端時會有最好的PPI反應，
所以將想研究Protein A、Protein B建構在NanoBRET™ PPI MCS 與Flexi® Start System，
各會得到8個載體 (見圖五)。
| NanoBRET™ PPI MCS Starter System Components | ||
| 品名 | 包裝 | 貨號 |
| pHTC HaloTag® CMV-neo Vector | 20μg | G7711 |
| pHTN HaloTag® CMV-neo Vector | 20μg | G7721 |
| pNLF1-N [CMV/Hygro] Vector | 20μg | N1351 |
| pNLF1-C [CMV/Hygro] Vector | 20μg | N1361 |
| NanoBRET™ PPI Control Pair (p53, MDM2) | 2x20μg | N1641 |
| NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System | 200 assays | N1661 |
| NanoBRET™ PPI Flexi® Starter System Components | ||
| 品名 | 包裝 | 貨號 |
| pFN21A HaloTag® CMV Flexi® Vector | 20μg | G2821 |
| pFC14K HaloTag® CMV Flexi® Vector | 20μg | G9661 |
| pFN31K Nluc CMV-neo Flexi® Vector | 20μg | N1321 |
| pFC32K Nluc CMV-neo Flexi® Vector | 20μg | N1341 |
| NanoBRET™ PPI Control Pair (p53, MDM2) | 2x20μg | N1641 |
| NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System | 200 assays | N1661 |
NanoBRET™ PPI MCS與Flexi® Starter System客製化服務
訂購NanoBRET™ PPI MCS與Flexi® Start System，並提供嵌入子序列 (insert sequence)
及DNA模板 (template DNA)，本公司即可為您進行客製化服務!(註:insert長度3kb以內)
客製化結果包含:
1.原始載體
2.客製化載體(含insert)
3.Cloning實驗流程報告
4.Insert定序報告(紙本+電子檔)
圖六、八種NanoBRET™ 反應組合
二、挑出NanoBRET™反應最好的組合
將8種Protein A跟Protein B組合，以1:1轉染到細胞內，最後用NanoBRET™ Nano-Glo® Detection
System 測定NanoBRET™反應，挑出BRET反應最好的組合進行後續的實驗(見圖六)。
Prebuilt NanoBRET™ PPI Assays (買現成的)
原廠建立的NanoBRET™ PPI Assays，已經挑選出反應最好的組合，可以節省建構載體及挑選載體組合的時間，您可以依照以下類別選擇：
Bromodomain Assays
| ＊ BRD 4/Histone H3.3 Interaction Assay | BRD4 BD1BD2/Histone H3.3 | PCAF/Histone H4 | BRDT/Histone H4 |
| ＊ BRD 4/Histone H4 Interaction Assay | BRD4 BD2/Histone H3.3 | SMARCA2/Histone H4 | BRPF1α BD1/Histone H4 |
| ＊ BRD 9/Histone H3.3 Interaction Assay | BRD7 BD/Histone H3.3 | TAF1(BD1BD2)/Histone H3.3 | BRPF2/Histone H4 |
| ＊ BRD 9/Histone H4 Interaction Assay | BRD7/Histone H3.3 | ATAD2 BD/Histone H4 | BRPF3/Histone H4 |
| ＊ BRPF1/Histone H3.3 Interaction Assay | BRDT/Histone H3.3 | BAZ2A/Histone H3.3 | CBP/Histone H4 |
| ＊ BRPF1/Histone H4 Interaction Assay | BRPF1α BD1/Histone H3.3 | BRD2 BD1/Histone H4 | CECR2 BD/Histone H4 |
| ＊ CBP/Histone H3.3 Interaction Assay | BRPF2/Histone H3.3 | BRD2 BD2/Histone H4 | CECR2/Histone H4 |
| ATAD2/Histone H3.3 | BRPF3/Histone H3.3 | BRD2/Histone H4 | GCN5/Histone H3.3 |
| ATAD2/Histone H4 | CBP BD/Histone H4 | BRD3 BD1/Histone H4 | MLL1/Histone H3.3 |
| BAZ2A/Histone H4 | CECR2 BD/Histone H3.3 | BRD3 BD2 Histone H4 | P300 BD/Histone H4 |
| BRD2 BD2/Histone H3.3 | CECR2/Histone H3.3 | BRD3/Histone H4 | PCAF/Histone H3.3 |
| BRD2/Histone H3.3 | EP300/Histone H3.3 | BRD4 BD1BD2/Histone H4 | SMARCA2/Histone H3.3 |
| BRD3 BD1/Histone H3.3 | GCN5/Histone H4 | BRD4 BD2/Histone H4 | TAF1(BD1)/Histone H3.3 |
| BRD3 BD2 Histone H3 3 | MLL1/Histone H4 | BRD7 BD/Histone H4 | |
| BRD3/Histone H3.3 | P300/Histone H4 | BRD7/Histone H4 |
Other Epigenetic Assays
| BRD4/CDK9 | HDAC1/HDAC2 | BRD4/NFKB(RelA) | KDM4A/Histone H3.3 |
| BRD4/TWIST | KDM4B/Histone H3.3 | CBX1/Histone H3.1 | KDM4C/Histone H3.3 |
| CBX2/H3.1 | KDM4D/Histone H3.3 | CBX3/Histone H3.1 | KDM5A/Histone H3.3 |
| CBX4/Histone H3.1 | L3MBTL3 3MBT Domain/Histone H4 | CBX5/Histone H3.1 | L3MBTL3/Histone H4 |
| CBX7/Histone H3.1 | LSD1/Histone H3.3 | CBX7/Histone H3.2 | MLL1/Menin |
| CBX7/Histone H3.3 | OGT/H2A | EED1/Histone H3.1 | OGT/H2B |
| EED1/Histone H3.3 | PRMT5/RIOK1 | EZH2/Histone H3.3 | PRMT5/WDR77(MEP50) |
| EZH2/EED1 | SETD1A/Histone H3.3 | EZH2/Histone H3.1 | TET3/Histone H3.3 |
| EZH2/SUZ12 | TUDOR/Histone H3.3 | FANCD2/Ubiquitin |
Transcriptional Protein Assays
| ＊ cMyc/MAX Interaction Assay | FOXP3/NFATC2 | MycN/AURKA | HIF1a/TIP60 |
| ＊ p53/MDM2(Control Pair) | HIF1A TAD/EP300 | EP300/HIF1a | LMO2-VPR/LDB1 |
| cMyc/AURKA | IRF/IRF (Dimerization) | FOXP3/FOXP3 | MED13/MED26 |
| ER/ER(Dimerization) | MED12/MED26 | GR/GR (Dimerization) | SP140/Histone H3.3 |
Signaling Proteins and Kinase Assays
| ＊KRas/BRaf Interaction Assay | KRas(G12C)/cRaf | KRas (WT)/cRaf | KRas(WT)/bRaf |
| bRaf/bRaf (Dimerization) | MAVS/IFIH1 | bRaf/cRaf | MEK/ERK |
| BRD4/ß-catenin | MID1/Alpha4 | CD27/Traf2 | MycN/AURKA |
| cMyc/AURKA | SKP1/SKP2 | cRaf/cRaf (Dimerization) | SKP2/CKS1B |
| ERK/ELK | SKP2/p27 | FKBP/FRB | TCF7L1/ß-catenin |
Membrane Protein Assays
| GRB2/EGFR | MRAP MRAP (Dimerization) | SHC/EGFR | IL17RA/ACT1 |
| PD1/SHP-2 | |||
＊= NanoBRET™
圖一、LgBiT及SmBiT蛋白結構
榮獲2015年十大傑出創新獎 即時探究活細胞內蛋白間交互作用
NanoBiT™ Assay System
NanoBiT™ (NanoLuc® Binary Technology) 為Promega創新 的 蛋 白 互 補 分 析 系 統 (Protein complementation assay)， 所 使 用 的 冷 光 酶 為 史 上 最 亮 的 NanoLuc luciferase，承襲了它所有的優點- 極小的size！更亮的冷光！既可大幅降低對目標蛋白間交互作用的干擾，又可得到更顯著的訊號，非常適合用於即時偵測活細胞內蛋白交互作用！
NanoBiT® PPI Systems
NanoBiT®其中的Binary即表示本產品為二元體組成，是將原先小size的Nanoluc® luciferase分成兩個極 小 次 單 元 -SmBiT及 LgBiT (見圖一 )， 但 並 非 原 先NanoLuc單純地分成兩半，Promega將其分別進行最佳化篩選，LgBiT改善了原先的構型穩定度、冷光訊號再度增強、提升可溶性及表現量等，而SmBiT則篩選出對於 LgBiT低 親 和 度 (low affinity) 的 特 性 ， 以 降 低 non-specificity binding，減少背景值而提升實驗結果的差異度。
圖二、以LgBiT及SmBiT互補系統探討蛋白交互作用
將此二元體分別接上您的兩個目標蛋白，若此二目標蛋白結合，LgBiT及SmBiT即可結合成為具有活性的NanoBiT® Luciferase (見圖二)。其結果類似BRET，但差異在於NanoBiT®在加了luciferase substrate後並無energytransfer，而是直接收得NanoLuc單一冷光訊號，因此偵測儀器不需要濾片(filter)。
進行NanoBiT®實驗前，要注意需搭配的control，在這邊先引用一個重要的名詞 tool compound，此化合物是在文獻上已知，會影響您細胞中的目標蛋白對 (pair) 結合或分離，即該tool compound為activator或inhibitor。
而 control的 搭 配 分 為 兩 種 情 況 - 您 手 上 有 /無 tool compound： 若 有 ， 則 搭 配 的 control 組 即 是 此 tool compound的處理組；若無，則需要搭配一些negative control去證明您的實驗藥物處理後，確實影響目標蛋白結合或分離喔！
表一、NanoBiT® 與NanoBRETTM比較
NanoBRETTM與NanoBiT®我該選擇哪一種產品呢？
表一幫您整理此兩產品的比較給您參考，依照您的實驗需求去選擇較適合您的產品喔！
原理