Kinase Target Engagement

NanoBRET™ Target Engagement Assays 原理圖

 此系統為利用非放射性冷光共振冷量轉移(BRET- a nonradiative transfer of the luminescent energy from NanoLuc® luciferase to the fluorescent tracer)技術，依據加入tracer順序的不同，能偵測在活細胞中，待測藥物(test compound)與目標蛋白之間的親和力(affinity)與停留時間(residence time)的一套系統。第一步為表現帶有NanoLuc® luciferase tag的目標蛋白，加入固定濃度(必須先做tracer濃度最佳化實驗)帶有螢光的tracer，此tracer已經過優化，會與帶有NanoLuc® luciferase tag的目標蛋白特異性(specific)及可逆性(reversibly)結合產生BRET訊號(BRET reporter complex)，再加入待測藥物與tracer競爭，隨著藥物濃度的增加(dose-dependent)，其BRET訊號隨之下降，藉此偵測藥物與目標蛋白之間的親和程度。

Tracer濃度與BRET訊號關係圖

 Tracer為一個cell-permeable fluorescent 物質，​由於tracer與各種目標蛋白的親和力不同，開始實驗前必須做tracer劑量條件優化，此圖橫軸為tracer濃度，縱軸為BRET訊號，隨著tracer濃度增加，BRET訊號也隨之增加，到達一定濃度達到飽和，算出tracer EC50濃度，選擇接近EC50 (EC50–EC80)濃度，爾後固定tracer濃度來做分析。

Unlabeled Compound 濃度與BRET訊號關係圖

 此圖橫軸為Unlabeled Compound的濃度，縱軸為BRET訊號，從此圖可得知隨著不同種類的compound濃度增加，BRET訊號隨之下降，藉由計算各種compound EC50濃度，來比較不同藥物與目標蛋白之間的親和力。