【勁報第44期｜活體生物/細胞成像全紀綠】

Bioluminescent/Biofluorescent Imaging
(活體生物/細胞成像全紀錄)

基於細胞實驗的測定和動物成像研究，Bioluminescence imaging生物發光成像已被廣泛用於生物醫學研究和藥物開發中。隨著成像技術的發展與成熟，利用生物活體成像系統性研究，可以滿足不同領域與不同課題的研究需求，從宏觀在活體動物對疾病整體發展過程的觀測，到微觀對活體細胞動態變化與基因表達的即時觀測。研究員已可透過生物冷光或螢光標記技術，對多種研究對象進行標記，如免疫細胞、幹細胞、腫瘤細胞、基因、細菌、病毒、抗體、藥物…等。

♦ Luciferase用於活體成像的優勢
♦ In Vivo Imaging用於小動物活體成像
♦ Cell Imaging (In vitro Imaging)用於細胞成像

►Promega HaloTag® Technology
有別於一般的螢光蛋白標記只能有固定的應用及螢光種類，HaloTag®只需要做一次Target protein construct，搭配各種螢光HaloTag® Ligands，就可輕易轉換不同顏色的螢光，下游的應用也非常全面，囊括各種Cell image研究，像是蛋白定位(localization)、蛋白追蹤(Trafficking)...等，HaloTag®甚至可用來做蛋白純化(Purifcation)、蛋白交互作用(Interaction)、膠體分析(SDS-PAGE assay)...等

►Luciferase冷光酵素酶
發光具有特異性，只有在Substrate存在的情況下才會發光，而且曝光時間還會大大的縮短(e.g. Promega NanoLuc® brightness leads to short exposure times)，所以在Cell Image應用上更具優勢。

Part I, In vivo Imaging in Animal Model

文獻分享

♦病毒感染應用(小鼠，冠狀病毒，hRluc)
Shen, L. et al. (2019) High-Throughput Screening and Identification of Potent Broad-Spectrum Inhibitors of Coronaviruses. DOI: 10.1128/ JVI.00023-19. J. Virol. 93(12), e00023-19.

♦疾病研究應用(斑馬魚，心血管疾病，NLuc)
Thierer, James H., Stephen C. Ekker, and Steven A. Farber. "The LipoGlo reporter system for sensitive and specific monitoring of atherogenic lipoproteins." Nature communications 10.1 (2019): 1-14.

♦癌症學應用(小鼠，乳癌，NLuc & Firefly luciferase)

Stacer AC, Nyati S, Moudgil P, Iyengar R, Luker KE, Rehemtulla A, & Luker GD (2013). NanoLuc reporter for dual luciferase imaging in living animals. Molecular imaging, 12 (7), 1-13 PMID: 24371848

♦腸道菌應用(小鼠，腸道菌，NLuc)

Zhao, Ning, et al. "A novel universal nano-luciferase-involved reporter system for long-term probing food-borne probiotics and pathogenic bacteria in mice by in situ bioluminescence imaging." RSC Advances 10.22 (2020): 13029-13036.

♦寄生蟲應用(錐椿，克魯氏錐蟲，FLuc)

Henriques, Cristina, et al. "Bioluminescent imaging of Trypanosoma cruzi infection in Rhodnius prolixus." Parasites & vectors 5.1 (2012): 214.

♦植物基因應用(牽牛花，蛋白標記，FLuc)

Van Leeuwen, Wessel, et al. "The use of the luciferase reporter system for in planta gene expression studies." Plant Molecular Biology Reporter 18.2 (2000): 143-144.

Part II, Cell Imaging with NanoLuc & HaloTag Technology

♦Live-Cell Imaging Using the NanoLuc Technology
文獻分享

►追蹤蛋白位置應用:

研究細胞經藥物處理後，觀察蛋白位置的變化。

Hall, Mary P., et al. "Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate." ACS chemical biology 7.11 (2012): 1848-1857.

►觀察Ligand與GPCR結合的應用:

Alcobia, Diana C., et al. "Visualizing ligand binding to a GPCR in vivo using NanoBRET." IScience 6 (2018): 280-288

► 蛋白-蛋白交互作用的應用

利用NanoBRETTM技術，檢測藥物對於蛋白-蛋白交互作用的影響。

Machleidt, Thomas, et al. "NanoBRET A Novel BRET Platform for the Analysis of Protein–Protein Interactions." ACS chemical biology 10.8 (2015): 1797-1804.

► 即時偵測活細胞凋亡狀況

利用RealTime-Glo™ Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay系統可動態偵測活細胞中，PS外翻到膜外的狀況，搭配非細胞滲透性的螢光DNA染劑，可區分出早期凋亡及二級壞死兩種階段。

♦ HaloTag® Technology ~ A Powerful Tool for Localization, Imaging, Trafficking and Turnover

►How to start cell imaging by using HaloTag® Technology?

Fluorescent Labeling of HaloTag® Fusion Proteins

1.HaloTag® Protein Expression Vectors的選擇
2.HaloTag® Ligands的選擇

►HaloTag®應用實例/實力

1.Fixed-Cell Labeling Using the HaloTag® Technology
2.Multiplexing HaloTag® protein, other reporters and/or Antibodies in Imaging Experiments
3.Live-Cell Imaging Using the HaloTag® Technology
4.細胞自噬分析系統-Autophagy LC3 HiBiT Reporter Assay System

結語:
細胞與活體成像技術發展至今，技術已日漸純熟，廣泛應用於細胞活性、蛋白定位追蹤、疾病發展偵測、評估藥物效果及臨床前動物試驗等研究上，以光學影像方式，偵測細胞與體內真實反應，與體外實驗結果相呼應，使實驗數據更據說服力，增強文章豐富度與研究學者的信心。Promega在細胞成像實驗上，開發螢光與冷光一系列的產品，在螢光部分，提供多種HaloTag®螢光Ligands選擇，能輕易標定“多色螢光”，觀察蛋白在細胞中的分布及定位，在冷光部分，其高亮度與縮短曝光時間的特性，能容易觀察蛋白在活細胞中的分布情形。而在活體成像實驗上，開發能應用在活體冷光成像的技術，改善使用螢光蛋白，造成的自體螢光干擾，影響實驗結果判讀等非預期後果。