Live-Cell Protein Interactions

NanoBRET PPI System

BRET-based PPI

NanoBRET System是一種以距離為基礎(Proximity-based)的分析技術，透過量測生物發光蛋白供體(Donor)與螢光蛋白受體(Acceptor)之間的能量轉移，並計算NanoBRET ratio，以偵測特定蛋白質對之間的交互作用。

此分析系統採用經最佳化、藍位移(Blue-shifted)的NanoLuc融合蛋白作為能量供體，並以標記紅位移 NanoBRET™ 618 Fluorophore的HaloTag®蛋白作為能量受體。供體與受體訊號之間具有超過150 nm的光譜間距，可有效降低背景干擾，提升訊號解析度與準確性。

NanoLuc的發光亮度為目前用於BRET的其他Luciferase供體的30倍以上。當NanoLuc與HaloTag® 618配體處於≤10 nm的近距離時，即可發生NanoBRET能量轉移。

NanoBRET分析可於即時、活細胞條件下，使用全長蛋白並維持生理相關表現量，同時研究蛋白質交互作用的誘導與抑制機制，非常適合用於訊息傳遞、藥物作用機轉及蛋白質功能研究。

▲NanoBRET^®分析原理示意圖。
(A)當Protein A與Protein B發生交互作用時，NanoLuc^®–Protein A融合蛋白(能量供體)所產生的生物發光能量，會轉移至螢光標記的HaloTag^®–Protein B融合蛋白(能量受體)，進而產生NanoBRET^®訊號。
(B)NanoLuc^®的發光訊號(460 nm)與螢光HaloTag^® NanoBRET^® 618 ligand的放射訊號(618 nm)之間具有良好的光譜分離，透過量測兩者的訊號強度並計算 NanoBRET^® ratio，即可定量分析蛋白質之間的交互作用。

The NanoBRET PPI Assay

▲NanoBRET^® assay method overview.

NanoBRET^® ratio不受細胞數量影響，並與其他比例式(Ratiometric)分析方法相同，具有低變異性與高度重現性。其分析穩定性與可靠性可由下方所示的Z factor數據清楚驗證，顯示NanoBRET^®分析非常適合用於定量分析與高通量篩選應用。

NanoBRET比率與細胞數量無關，且與其他比率測定法一樣，具有低變異性和高重複性，如下面的Z因子所示。

▲範例BRET比值顯示蛋白質交互作用的誘導和抑制。

圖A：EGF誘導活化EGFR/GRB2交互作用。

圖B：JQ1抑制BRD4/組蛋白H3.3交互作用。

Product Feature

掌握真實生物學(Understand True Biology)

• 使用相容於活細胞的試劑，即時獲取動態數據
• 可偵測低表現量蛋白質的交互作用
• 支援全長蛋白或蛋白片段的交互作用研究

彈性高、穩定且可擴充，滿足不同研究需求

• 相容於 96 Well或 384 Well，適合高通量實驗
• 低實驗變異性、高重現性，數據可靠穩定
• 可同時偵測蛋白質交互作用的誘導與解離
• 適用於活細胞中小分子藥物篩選

Choose Starter Systems, pre-built or custom NanoBRET assays

NanoBRET 蛋白質交互作用(PPI)分析目前提供多種格式，可依不同研究需求靈活選擇，無論是快速導入或深度客製化應用皆能滿足。

Pre-built NanoBRET PPI assays

提供多款已完成最佳化的NanoBRET PPI分析套組，亦可依需求提供客製化分析材料，涵蓋多種重要蛋白質家族，包括但不限於：

• Bromodomain／組蛋白及其他表觀遺傳學標的
• 轉錄調控蛋白相關分析
• 訊息傳遞蛋白與激酶分析
• 膜蛋白相關分析

Pre-built assays分析試劑包含已最佳化的表現載體、蛋白質交互作用(PPI) positive control vector pair (p53／MDM2)、完整的實驗操作流程(Assay protocol)，以及足量的偵測試劑，可支援：

• 96-well plates：400次分析
• 384-well plates：1000 次分析

NanoBRET PPI Starter Systems

NanoBRET PPI Starter Systems 提供建立專屬蛋白質交互作用分析所需的完整工具。套組內含可用於建立目標蛋白融合構築的載體(Vectors)，可將NanoLuc luciferase與HaloTag分別融合至目標蛋白，並搭配足量的偵測試劑，可執行200 次分析。

NanoBRET PPI MCS Starter System

選擇 NanoBRET PPI MCS Starter System，可透過傳統分子克隆方式，將目標基因插入多重克隆位點(Multiple Cloning Site, MCS)，以建立N端或C端NanoLuc luciferase 與 HaloTag 蛋白融合構築。

NanoBRET PPI Flexi® Starter System

選擇NanoBRET PPI Flexi® Starter System，可使用 Flexi Vector Cloning System 建立N端或C 端NanoLuc luciferase與HaloTag蛋白融合構築。
Flexi 系統為一種具方向性的克隆方法，基於兩種稀有切位限制酶SgfI與PmeI，可在不同Flexi 載體之間高保真地轉移蛋白編碼區段，無需重新定序，大幅提升實驗效率與準確性。

此外，Find My Gene™服務提供多種已完成Flexi格式建構的ORF克隆，能快速、簡便地建立目標蛋白融合構築。

NanoBRET Positive Control

NanoBRET Positive Control包含轉染用載體 DNA，以及一個編碼NanoLuc-HaloTag 融合蛋白的質體。該融合蛋白可將NanoLuc供體與HaloTag受體緊密連結，以確保高效率的能量轉移。

此對照質體可作為儀器設定時的正向訊號對照，亦可在進行其他NanoBRET實驗時作為參考對照使用。

進行NanoBRET PPI (蛋白質交互作用)實驗時，需使用具備雙波長順序偵測能力的微孔板讀取儀，例如GloMax® Discover儀器。

NanoBRET PPI Positive Control Pair (p53, MDM2)

NanoBRET PPI正向對照配對是一組經過最佳化設計的表現載體，用於透過 NanoBRET檢測系統測量蛋白質互作對p53與MDM2之間的相互作用。

p53/MDM2系統可產生強烈且穩定的NanoBRET訊號，因此可用於儀器設定與系統校正，同時也可作為進行其他NanoBRET PPI實驗時的參考對照配對。

▲p53/MDM2 NanoBRET™ PPI Control Pair之代表性實驗數據。

Panel A：相對於特異性抑制劑Nutlin-3所建立之劑量反應曲線 (Dose-Response Curve, DRC)，顯示系統對抑制劑處理的敏感性與動態範圍。

Panel B 與 Panel C：分別為 96-well與384-well格式下的單一劑量測定結果，以及Z factor計算，用以評估實驗系統的穩定性與適用於高通量篩選的可靠性。

所有數據皆使用配備450 nm/8 nm BP與600 nm LP濾光片的GloMax® Discover 系統進行測定。

Product

NanoBiT Protein:Protein Interaction Assays

Structural complementation-based PPI

Sensitive detection of protein:protein interactions in live cells

NanoLuc Binary Technology (NanoBiT)採用結構互補(Structural complementation)策略，可在活細胞中即時偵測蛋白質間的相互作用。

在此系統中，NanoLuc luciferase被拆分為兩個小亞基：

• Large BiT (LgBiT，158 aa)
• Small BiT (SmBiT，11 aa)

這兩個小亞基經過獨立優化，具備高結構穩定性、極低自發結合親和力，以及高亮度發光特性。

在蛋白質交互作用研究中，LgBiT與SmBiT 分別與目標蛋白融合表現於細胞內。當兩個目標蛋白發生交互作用時，NanoBiT兩個亞基被拉近並重新組裝形成活性酵素，進而在底物存在下產生明亮的發光訊號。

由於SmBiT與LgBiT的本身親和力極低，因此系統中的訊號主要由目標蛋白之間的相互作用驅動，可有效降低背景訊號並提升偵測特異性。

▲NanoBiT 蛋白質交互作用偵測原理

LgBiT與SmBiT分別融合於蛋白質A與蛋白質B。當A與B之間不存在相互作用時，由於LgBiT與SmBiT之間僅具有極低的自發性結合能力(Kd = 190 μM)，因此發光訊號維持在低背景水平。

當蛋白質A與蛋白質B發生相互作用時，LgBiT與SmBiT被有效拉近並促進結構互補，進而重組形成具活性的Luminescent 酵素，產生極為明亮的冷光訊號。

 Benefits of NanoBiT:

• 小型且穩定的融合標籤，最大程度降低對目標蛋白功能的干擾
• 採用非裂解(Non-lytic)流程，可於活細胞中即時偵測蛋白質交互作用
• 極高亮度發光訊號，支援接近內源性表現量的交互作用偵測
• 融合蛋白可於極低表現量下進行分析，降低實驗假象(Artefacts)
• LgBiT與SmBiT經最佳化設計，適用於可逆性互作並降低非特異性結合
• 適用於全長蛋白、片段或突變體之交互作用分析
• 操作流程簡單，無需特殊檢測設備
• 已驗證適用於96、384與1536-well高通量格式

 The NanoBiT PPI Assay

 ▲活細胞即時蛋白質動態分析

在加入Nano-Glo® Live Cell Reagent後，即可於活細胞中即時追蹤蛋白質的動態變化。該試劑為非裂解型(Non-lytic)檢測試劑，內含可穿透細胞膜的Furimazine底物，可在不破壞細胞完整性的情況下進行連續量測。

此特性使NanoBiT/NanoLuc系統能夠長時間監測蛋白質交互作用的即時變化與動力學行為，特別適用於研究可逆性蛋白質互作、訊號傳遞及藥物作用機制。

NanoBiT PPI Starter Systems

NanoBiT提供兩套Starter System，內含建立LgBiT與SmBiT融合蛋白所需之表現載體，並包含一組構成型正向對照配對(PRKACA:PRKAR2A)及一個負向對照載體。

系統同時搭配Nano-Glo® Live Cell Assay System，為單一步驟加入、非裂解型的活細胞檢測試劑，可即時監測NanoBiT冷光訊號。該試劑由Nano-Glo Live Cell Substrate 與Nano-Glo LCS Dilution Buffer 稀釋配製而成，兩者皆經最佳化設計，可在有或無血清條件下提升穩定性並降低自發性背景訊號，進而提高低訊號偵測靈敏度。

另提供FKBP:FRB作為誘導型正向對照配對。
系統採用HSV-TK 啟動子，於哺乳類細胞中提供穩定且低表現量的構成型表現。
LgBiT 與 SmBiT 融合蛋白可使用 FuGENE® HD 或 ViaFect® 轉染試劑轉染至目標細胞株。

 NanoBiT 交互作用變化分析

NanoBiT分析可用於監測蛋白質交互作用的變化，包括交互作用的誘導(Induction)或抑制)(Inhibition)，並可依研究需求進行動力學(Kinetic)分析或終點(Endpoint)分析。

▲AR dimerisation之 NanoBiT分析代表性實驗設計

將HEK293細胞轉染表現與雄性素受體(Androgen Receptor, AR)融合之LgBiT與 SmBiT蛋白，並進行過夜培養。

Panel A｜動力學(Kinetic)分析
為即時監測AR二聚化，於 37°C下連續量測發光訊號30分鐘。隨後向Well中加入Vehicle對照或最終濃度為100 nM的R1881(AR 致效劑)以誘導AR 二聚化，並持續量測發光訊號60分鐘。

Panel B｜終點(Endpoint)分析
為評估 AR 二聚化的劑量反應，向孔中加入不同濃度的 R1881，並於化合物加入後 30 分鐘量測發光訊號。

此實驗展示NanoBiT系統可同時支援即時動力學監測與終點分析，用於研究受體二聚化及配體誘導之蛋白質交互作用。

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