Cytokine and Growth Factor Bioassays

細胞的生長及分化過程是由許多Cytokines、Growth factors與相關的Cellular signaling pathways來調節，是多種因素互相調控的複雜網路，用藥物或任何調節劑去改變或破壞此調控網路，將會導致不同程度的疾病發生，例如免疫抑制、肝毒性和癌症。反之，相關的Biologics藥物也可有效地減緩病症或達到治療的效果。

此系列Bioassay，可用於檢測及定量Ligands、或是辦認Ligands及Receptor的抗體的活性，對於在各種Biologics藥物，例如新藥、Biosimilars或Biobetters的開發過程中，提供靈敏度高又穩定的方式，提升藥物檢測的流暢度，加快整個藥物開發的進程。

Cytokine/growth factor bioassay principle

VEGF Bioassay

Background

Vascular endothelial growth factor (VEGF) 血管增生因子，主要是由上皮細胞、腫瘤細胞及巨噬細胞分泌，功能是會刺激血管新生、增加血管通透性、增加腫瘤的侵襲與存活，還會抑制調控型T cell的抗腫瘤反應，目前已知的VEGF receptors 有多個subtypes(VEGFR1, VEGFR2 and VEGFR3. VEGFR2 (also known as KDR))；VEGF則是有四種isoforms(VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 and VEGF-206)，人體內主要表現的isoform是VEGF-165。

與VEGF異常表現相關的疾病有: 癌症（生長，侵襲和轉移性傳播），血管疾病（眼睛的視網膜或身體的其他部位）:

• 腫瘤細胞：促進上皮 - 間質轉化表型，增強腫瘤侵襲和存活，促進癌症幹細胞的功能
• Marophage：增加血管通透性，導致纖維蛋白基質的沉積，從而觸發促纖維母細胞瘤的形成。
• Treg遷移：抑制抗腫瘤免疫反應

目前幾個VEGF相關上市藥物(E.g. 樂舒晴Ranibizumab (Lucentis)、采視明Aflibercept(Eylea)及癌思婷Bevacizumab (Avastin)...)，其藥物專利即將於2020-2025陸續到期，代表Biosimilar的開發會越來越熱門，不僅是學術研究，藥廠開發計畫中對於VEGF這個Target也是持續的高度重視。

Assay作用原理

KDR/luciferase reporter Effector Cells，表面上的KDR(也就是VEGFR2)接受到VEGF dimer的訊號後，下游就會活化luciferase表現。 如果加入anti VEGF/VEGFR2 Ab，做了block之後，就不會產生下游訊號，冷光表現下降。

Assay Workflow

使用Promega專利研發的穩定TnU cell，解凍細胞後，即可立即進行Assay，操作流程可縮段至半天內，即可得到數據，步驟簡單，容易建立實驗室標準流程及技術轉移，減少人為操作變因，大大提升系統穩定性。

Applications

• Confirm VEGF-mediated MOA.
• Evaluate antibodies raised against VEGF.
• Measure antibody potency and stability.
• Screen and rank-order antibodies.
• Measures the potency of murine VEGF.

Example data

On-market drug test: 先使用Recombinant human VEGF將訊號活化，在加入序列稀釋的抗體藥物做Blocking assay.

Tolerates of human serum: 對血清的耐受性高，不用擔心Biological sample中複雜成分的干擾

IL-2 & IL-15 Bioassay

Background

Interleukin-2 (IL-2)及Interleukin-15 (IL-15)原本都是被形容成T cell growth factor，分別於1976及1994年被發現，其作用為:
IL-2: 是一個15.5kDa monomer，由多種細胞種類分泌，像是CD4+ and CD8+ T cells, NK cells and activated dendritic cells，對免疫系統有多方面的作用:

• CD4+ Treg cells的生產，維持，擴增
• 促進NK及CD8+ cells的cytotoxic activity
• 活化harmful autoreactive T cells的細胞死亡機制，以保持免疫反應的平衡

IL-15: 是一個14.5kDa monomer，monocytes, macrophages, dendritic and epithelial cells都會分泌IL-15，主要作用是會促進NK, NKT cell and CD8+ memory T cells的活化及擴增。

由於IL-2 & IL-15 receptor都是三聚體的結構，且共用其中兩個subunits，下游活化的路徑也相同，主要分辨不同cytokine的是Rα，在使用傳統的PBMC cell assay較難區分兩者的機制，而Promega reporter bioassay是屬於Receptor Specific，可突破傳統法無法克服的限制。

Assay作用原理

Reporter bioassay cell，表現IL-2 / IL-15 receptor，受到Cytokine刺激就會活化下游訊號來表現冷光。

Assay Workflow

使用TnU cell，簡單的操作流程即可完成實驗

Applications

• Biosimilar drug development.
• Confirm IL-2 or IL-15 mediated MoA.
• Measure cytokine potency and stability.
• Qualification of cytokines used in the manufacture of cell therapy products.
• Screen and rank-order biologics.

Example data

IL-2 Bioassay，加入IL2 or IL15，搭配Anti-CD25(IL2 receptor的alpha chain component)做receptor block，可看到IL-2 bioassay with IL2的response下降。