【勁報第41期｜Target mission~Drug screening高通量藥物篩選平台】

藥物篩選是現代藥物開發流程中，檢驗和獲取具有特定生理活性化合物的一個步驟，系指通過規範化的實驗設計，從大量化合物或是新化合物中，選擇對某一特定作用靶點具有較高活性化合物的過程，關於常用的藥物篩選有兩種模式，分別為生化模式(Biochemical)與細胞模式(Cell-base)。

那甚麼是高通量藥物篩選[High Throughput Screens (HTS)]技術呢?
        高通量篩選最初是伴隨組合化學而產生的一種藥物篩選方式。1990年代末，組合化學的出現，改變了人類獲取新化合物的方式，人們可以通過較少的步驟，在短時間內同時合成大量化合物，在這樣的背景下，高通量篩選的技術應運而生。此技術是應用於化學(Chemistry)和生物學(Biology)領域相關的科學方法，其成千上萬的實驗樣本，在給定條件下同時進行測試。樣本本身可以為生化試劑的形式，例如:化合物、胺基酸或活細胞。隨著自動化執行樣本製備、處理及分析數據的發展，科學家可以短時間藉由HTS技術蒐集大量實驗數據，來回答複雜的生物學問題。現今HTS已廣泛應用於製藥學(Pharmacy)、生物技術(Biotechnology)和學術研究機構(Academic institution)，舉凡開發新藥、藥物標靶驗證及鑑定可調節生物訊息傳遞的基因與蛋白等。   

跳脫傳統的做法，Promega要給您不可不知的藥物篩選系統:

1. 活細胞Protein:Protein Interaction (PPI) 蛋白質-蛋白質交互作用分析

NanoBRET™ & NanoBiT® Protein-Protein Interaction System
        蛋白質-蛋白質交互作用在轉錄、細胞分裂、訊息調控、致癌性轉化及細胞死亡調控中均扮演重要角色。不良的磷酸化會造成蛋白-蛋白交互作用之異常，導致細胞不正常增生，進而引起癌症及疾病的發生，使得蛋白-蛋白交互作用成為疾病治療的重要標的。透過研究這些交互作用，人們可以更深入了解疾病，進而成為研發新治療方法的基礎。
Promega提供您多套研究蛋白質交互作用系統，包括能即時偵測在活細胞當中，蛋白質交互作用的NanoBRET™與NanoBiT®系列產品。

其NanoBRET™活細胞 PPI 分析系統原理:
        NanoBRET™為改良版的冷光共振能量轉移(BRET)系統，使用史上最亮NanoLuc® luciferase (比Rluc量高達150倍)做為能量的供體Donor，並以HaloTag®接上NanoBRET™618螢光基團，作為能量受體來測量特定蛋白質之間相互作用，當兩蛋白間距離夠近 (< 10 nm) ，NanoLuc® Luciferase激發NanoBRET™618螢光基團產生BRET訊號。

        NanoBRET™大幅改善傳統BRET之Donor與Acceptor放射光光譜重疊的問題 (Spectral separation)，降低背景值，提供最靈敏的分析，除了可用於偵測活細胞內蛋白的交互作用，也是篩選影響蛋白-蛋白交互作用的絕佳工具。


►Donor channel ( 460 nm) 使用Band pass filter，Acceptor channel (610 nm) 使用Long pass filter，
    BRET訊號值是以Acceptor signal與Donor signal的比值方式呈現。



 

2. NanoBiT® 活細胞 PPI 分析系統原理-榮獲2015年十大傑出創新獎 

       NanoBiT®為Promega創新的蛋白互補分析系統(Protein complementation assay)，所使用的冷光酶為史上最亮的NanoLuc® luciferase，承襲了它所有的優點，具有超小的Size、更亮的冷光，既可大幅降低對目標蛋白間交互作用的干擾，又可得到更顯著的訊號，非常適合用於即時偵測活細胞內蛋白交互作用！
本產品為二元體組成，是將原先小Size的NanoLuc® luciferase分成兩個極小次單元-SmBiT及LgBiT，但並非原先NanoLuc®單純地分成兩半，而是將其分別進行最佳化篩選，LgBiT改善了原先的構型穩定度、冷光訊號再度增強、提升可溶性及表現量等，而SmBiT則篩選出對於LgBiT低親和度(Low affinity)的特性，以降低非專一性結合(Non-specificity binding)，減少背景值而提升實驗結果的差異度。將此二元體分別接上您的兩個目標蛋白，若此二目標蛋白結合，LgBiT及SmBiT即可結合成為具有活性的NanoBiT Luciferase。     




那我該如何選擇NanoBRETTM還是NanoBiT®產品呢？
透過以下表格，再依照您實驗上的需求，就能選擇較適合您的產品呢!



傳統式或是新世代NanoBRETTM 及NanoBiT® PPI系統，二者差異性完整對照表，讓您一目瞭然!!



2. Autophagy Assay-偵測細胞自體吞噬(Autophagy)的活性

1.Autophagy LC3 HiBiT-HaloTag Reporter Assay

        Promega以NanoBiT®技術為基礎開發偵測細胞自噬程度的Autophagy LC3 HiBiT-HaloTag Reporter，此系統為利用轉殖載體使細胞表現帶有HiBiT tag與HaloTag®的Human LC3 protein，當Autophagy發生時，LC3 reporter蛋白被自噬體(Autophagosome)吞噬降解，這時再加入Nano-Glo® HiBiT Lytic試劑，試劑包含LgBiT 與Furimazine substrate，未被降解的HiBiT tag融合蛋白會與LgBiT結合，並在Furimazine substrate作用下發出冷光訊號，因此冷光訊號與細胞自噬程度呈反比，藉以偵測細胞自體吞噬的程度，使用冷光盤式讀取的方法具有可高通量篩選(96, 384 wells)、靈敏度高、可定量、訊號強容易判讀與適用於2D 與3D Cell culture系統等特性，另外可搭配HiBiT protein blotting，藉以分析細胞自噬的機制，也能利用HaloTag imaging觀察Puncta於細胞中的分布情形，此產品除了提供載體之外，另有(Ready-to-use)的HEK293與U2OS細胞株，提供客戶選用。




 


    
►HaloTag Ligands利用共價鍵結的方式與
HaloTag protein做高度緊密結合


      使用U2OS Autophagy LC3 HiBiT Reporter Cells，搭配Janelia Fluor® 646 HaloTag® Ligand HaloTag® Imaging系統，偵測加入Autophagy stimulator (PP242)、晚期Autophagy inhibitor (Baf A1)與早期Autophagy inhibitor(WN) 4小時後，觀察Puncta於細胞中的分布情形，結果如下圖所示:
 




 

3. 藥物代謝，CYP450活性檢測
       現代人因為飲食習慣、工作壓力大、生活忙碌…等，常會在身體不適時先去藥局買一些成藥應急，或是習慣性的準備各種腸胃藥，止痛藥在身邊，不知不覺就服用了許多藥物，造成身體負擔；或是患有慢性病的患者，像是高血壓、糖尿病…等，這種持續或長期的健康狀況問題或疾病困擾的人們，必須定時的服用控制病情的藥物，時間久了吃下的藥物量也是非常驚人。
對於需要長期服藥的慢性病患者來說，有些患者會認為藥物無顯著效果或是有毒性會損害身體，並導致一些副作用，所以自行停藥的案例也時有耳聞，畢竟此類藥物主要是控制病情而無法有使慢性病痊癒的療效，如果在沒有醫生診斷的狀況下，吃錯藥物或是自行調整藥量將會導致病情延誤，造成無法挽回的狀況。

病患都身體不適了，還每天吞下那麼多的藥丸怎麼可以有毒?
不同的藥物的確有著不同程度的毒性，藥廠在藥物開發的過程，必須確認藥物是否可以順利被身體代謝，代謝的途徑及安全劑量也很重要，也就是ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion)研究，這是藥物開發的必要環節，讓醫療人員了解如何正確使用藥物，並在療效及用藥安全性中取得平衡，也是藥物安全評估的底線。目前，藥物代謝的研究方式以偵測肝臟中Cytochrome P450 (CYP450，細胞色素P450酵素)的代謝活性最為熱門，尤其對於新藥的成功上市，絕對少不了精確的CYP450活性分析結果。

Cytochrome P450介紹
        CYP450是一群含血紅素的代謝酵素(Heme-containing enzymes)，大多分布於肝臟細胞的內質網及粒線體內膜上，負責藥物的代謝，並與藥物間交叉反應(Drug-drug interactions) 調控密不可分；CYP450主要作用方式是將化合物轉變成較少毒性較具水溶性的產物，由於CYP450在還原態下會與CO形成複合物，於 450nm會產生最大的吸收波峰，因此被稱做細胞色素P450。




如何檢測CYP450?
       冷光技術已廣泛應用於細胞活性偵測、訊息傳遞機制探討、藥物開發(ADME)及臨床前動物試驗等研究上。此外隨著冷光多功分析的技術與觀念日漸成熟，使研究人員多採用冷光多功分析於細胞CYP450的研究，意即“從同一細胞樣品中收集CYP450活性與細胞存活”之數據，因而可獲得更完整的資訊並減少實驗數據的差異性。
Promega提供的均質、長效的冷光試劑，P450-Glo™ Assay and Screening System，可偵測源自合成或生物樣本中的CYP450 sample，也可用於篩選、測試藥物或是新化合物對CYP450活性的影響。

1.P450-Glo™ Assay and Screening System

 產品原理 
        利用一個CYP450冷光前驅物(P450-Glo™ Substrate)，當被CYP450剪切後，釋放出Aminoluciferin，
再與試劑中的Ultra-Glo™ Luciferase作用產生的冷光，冷光訊號的強度與CYP450活性成正比，
除了檢測試劑P450-Glo™ Assay，P450-Glo™ Assay Screening System中提供CYP450酵素，
讓使用者可直接用於藥物篩選。
               


 操作方式 
就如同其它Promega冷光產品儀相同，P450-Glo™的使用步驟簡單，只需”加-混-測”三個基本步驟而已，如圖所示，先將Reconstitution Buffer與Luciferin Detection Reagent混和後，加入盤中均勻混和，即可用冷光儀讀取冷光訊號。



 檢測細胞內CYP450活性 
       不只用於Biochemical Assays，P450-Glo™ Substrate及反應產物 (Aminoluciferin) 具有細胞滲透性，可用於Cell-Based Assays，操作方式有裂解性及非裂解性 (aliquot of intact-cell supernatant) 的做法可選擇，可彈性調整甚至搭配其它檢測做多功分析 (Cell health assay or other P450-Glo™ ) 。

 3D culture model+多功分析也可以! 
        P450-Glo™ CYP3A4 Assay & Cell Viability (CellTiter-Glo® 3D) Assay in human liver microtissues (~225µm; InSphero)*。

 
►勁報40期


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