【勁報第43期｜探索記憶的黑洞-神經退化性疾病】

沉默的流行病(Silent epidemic disease)」--
 神經退化性疾病(Neurodegenerative disease) 

神經退化性疾病是一種腦部及脊髓細胞失去功能的症狀。腦部及脊髓細胞是由神經元所構成，負責不同功能，例如運動、處理訊息、進行判定。由於神經元的惡化或是髓鞘隨著時間而失去功能，都可能會造成神經退化性疾病。因為腦部及脊髓細胞不易大量再生，所以只要一受損便可能造成永久性的傷害，病患可能要經過數個月或數年，通常是在很多細胞死亡或是細胞功能停止時，一部份腦部開始失去功能之後，症狀才會被注意到，且隨著時間症狀會更加嚴重。
以下就來為大家介紹幾種蛋白與神經退化性疾病的關係!

一、Synuclein Protein Type
♦Alpha-Synuclein Protein:
Alpha-Synuclein蛋白是誘發帕金森氏症關鍵蛋白之一，由SNCA基因編碼，大小為14 kDa，其結構包含N-terminal domain (aa 1–65)、Nonamyloid-Beta component of plaques (NAC) domain (aa 66–95)、與C-terminal domain (aa 96–140)(如下圖)。
其中的NAC區域使得Alpha-Synuclein與另2個Synuclein蛋白(Beta-Synuclein與Garma-Synuclein)不同，具有自我聚合(Self-polymerization)，形成纖維蛋白的能力。




在1997年首次描述Alpha-Synuclein錯義突變Missense mutation (*A53T)與家族性帕金森氏病有關，從此越來越多與帕金森氏症的N端錯義突變的蛋白，包括A30P, E46K, H50Q, G51D, A53E, A18T與pA29S5。目前研究指出薑黃素(一種抗氧化劑)被證實能防止因為A53T誘導的細胞死亡。Alpha-Synuclein蛋白還可通過抑制蛋白乙醯化而促進神經毒性的產生。
 

♦試驗模式:
StressMarq擁有多種具活性的Alpha-Synuclein纖維蛋白，可適用於體外體內實驗。*體外試驗部分: 人類與小鼠Type 1 Preformed fibrils(PFFs)和Monomers 經過神經元細胞培養後，可誘導內源性Alpha-Synuclein磷酸化蛋白，形成路易氏體Oligomerization，並可透過Thioflavin T assay檢測得知結果。

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 補充說明: 
什麼是Thioflavin T (Th-T) assays? 
Th-T是一種被廣泛使用於鑑定蛋白質是否含有類澱粉纖維結構的螢光染劑，Th-T會快速且具專一性地和反平行(Antiparallel) Beta-sheet 結構的類澱粉纖維結合，但卻不會與蛋白質單體或是寡聚體(Oligomer)中間產物結合，當固定螢光激發(Excitation)波長於450 nm時，若溶液中含有類澱粉纖維，在482 nm波長就會出現最大螢光放射(Emission)波峰。我們擁有Thioflavin T assays相關試劑(USBiological)與偵測儀器(Promega)，想知道更多資訊請參考原廠網頁。

         

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♦Beta-Synuclein Protein
Beta-Synuclein與Alpha-Synuclein一樣，位於突觸前神經末梢。主要功能是維持囊泡膜曲率(Vesicular membrane curvature)，並在正常生理情況下不會聚集。Beta-Synuclein會抑制Alpha-Synuclein聚集，而突變的(V70M與P123H)Beta-Synuclein與DLB有關。人類的Beta-Synuclein PFFs不會在大鼠海馬迴神經元誘導內源性Alpha-Synuclein聚集，因此常作為Alpha-Synuclein相關實驗的控制組。
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♦Garma-Synuclein Protein
Garma-Synuclein平常是以未折疊構型存在，並容易在溶液中聚集成小且可溶性低聚物(Oligomer)。其Methionine 38位點上的氧化，容易導致Garma- Synuclein的聚集(如圖七)，這在路易氏症病人大腦杏仁體→路易氏症病人大腦的杏仁核(Amygdala)和黑質(Substantia nigra)的神經元與神經突觸中被發現。而在ALS的病患也有Garma- Synuclein的聚集，進而導致運動神經元死亡。
Alpha-Synuclein與Garma-Synuclein的結構與聚集方式相近，在帕金森氏症與路易氏體失智症[Dementia with Lewy Bodies(DLB)病患中，可以觀察到Alpha-Synuclein與Garma- Synuclein蛋白的病變。
而在阿茲海默症的病患中，可觀察到氧化的Garma-Synuclein和磷酸化的Alpha-Synuclein蛋白。在Garma-Synuclein最容易被氧化的Metathionine 39 與 Tyrosine 39位點，會促進Alpha-Synuclein蛋白的聚集。有研究指出Garma-Synuclein是通過外泌體(Exosomes)從神經元中分泌出來的，進一步傳送到神經膠質細胞。
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二、Tau Protein
AD是以德國著名的神經病理學家和精神病醫生Alois Alzheimer的名字命名，他於1906年觀察到因精神病而死亡的患者，其大腦中有異常的團塊(Clumps)和纖維束纏結(Tangled fibrous)，從此澱粉樣斑塊(Amyloid plaques)和纖維束纏結成為診斷阿茲海默症的主要標誌。Tau蛋白是神經纖維束纏結的主要成分，在AD的發病機理中扮演重要的角色。
隨著人口老齡化的增加，研究Tau蛋白病理學，開發新治療發法十分迫切。
目前已提出幾種分子機制作為病理學的基礎，包括:磷酸化(Phosphorylation)、截斷化(Truncation)、乙醯化(Acetylation)、泛素化(Ubiquitination)和磺酰基化(Sumoylation)等，其中磷酸化是迄今為止最被廣泛研究的機制。



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三、SOD1 Protein
Superoxide dismutase (SOD)是體內幾乎所有細胞中都存在的內源性細胞內酶(Intracellular enzyme)，作用是催化超氧自由基(O2 –)為O2與H2O2，再由過氧化氫酶(Catalase)和穀胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase)代謝為H2O與O2。通常SODs在抗氧化防禦機制中扮演重要的角色，保護生物體免受氧化損傷。在哺乳類動物中主要兩種SOD類型，其中一種是SOD1，包含Cu與Zn離子作為同型二聚體，存在於細胞質中。而Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1)的錯誤摺疊和聚集成Neurotoxic species與ALS有關。
SOD1 Protein產品資訊:

 四、TTR Protein
TTR又稱Prealbumin，是一種運輸蛋白，在血清中會形成四聚體(Tetrameric protein)，與甲狀腺素和視網醇結合蛋白(Retinol binding protein)的運輸有關，此一蛋白主要在肝臟生成，主要存在於血漿中，少部分形成於腦部的脈絡叢(Choroid plexus)或眼底的感光組織(如視網膜)，而TTR的錯誤摺疊與類澱粉沉積症有關，它可聚集成原纖維並沉積在心臟和神經系統中，稱為甲狀腺素運輸蛋白類澱粉沉積症(Transthyretin amyloidosis)。
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六、Summary重點整理
引起單一神經退化性疾病的蛋白可能不只一種，相關蛋白間的交互作用也是現今科學家研究的重點之一，
例如: Alpha-Synuclein會促進Tau蛋白的聚集，在超過一半的AD患者腦部有路易氏體的發現，並在病患腦脊液(Cerebrospinal fluid, CSF)中發現大量的Alpha-Synuclein蛋白。以下為疾病與相關蛋白的表格，幫助大家更了解疾病與關鍵蛋白的對應關係。

  產品常見FAQs 

1.如何確定樣品的純度？
Ans:使用SDS-PAGE確認純化後的蛋白質純度，並評估有多少單體α-Synuclein蛋白轉化為原纖維(Fibrils)的量，其QC標準為不溶物必需＞90%。
 

2.以何種方式偵測PFF的活性？
Ans:使用Thioflavin T (Th-T) assays。
 

3.PFF QC的執行方式?
Ans:使用SDS-PAGE確認純度，並以Sedimentation assays確認大多數單體蛋白轉化為原纖維，所有Batches/Lots都會附上EM成像圖片。
 

4.應該選擇何種蛋白當PFF的控制組別？
Ans:這取決於User的實驗設計，建議選擇每種PFF的起始單體蛋白來源當控制組，例如:將Active Human Recombinant Alpha-Synuclein Protein Monomer (Type 2)(SPR-316)與Active Human Recombinant Alpha-Synuclein Pre-formed Fibrils (Type 2) (SPR-317)搭配使用，另外Beta-Synuclein PFFs也可以拿來當作Alpha-synuclein PFFs的控制組。
 

5.是否有做PFF體內試驗?
Ans: Active Human Recombinant Tau (K18), P301L mutant Protein Pre-formed Fibrils (SPR-330)已被測試注射到P301L轉基因小鼠中，植入內源性磷酸化和Aggregate的Tau蛋白。而Active Human Recombinant Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils (Type 1)(SPR-322)和Active Mouse Recombinant Alpha-Synuclein Pre-Formed Fibrils (Type 1)(SPR-324)測試過可以在大鼠體內植入內源性Alpha-Synuclein蛋白，並注射PFF能引起大鼠病理的發生。
 

6.單體Alpha-Synuclein蛋白會自發性轉化為纖維蛋白(Fibrils)嗎？
Ans: 建議將單體蛋白在冰上解凍使用，以防止任何自發性產生原纖維化。如果不在冰上解凍的情況下，而發生任何自發性原纖維化，則聚集的量也是非常少量，因為聚集通常需要靠搖動與攪動產生。

結語
現階段治療神經退化性疾病的藥物，尚無有效的治療方法，都是以延緩病情惡化為主，目前已有許多直接利用CRISPR技術來治療精神疾病及神經退化性疾病的文獻，明顯加速了這些疾病的研究進度，許多相關研究正在進行細胞實驗，有些甚至已在動物實驗中成功，經由移植幹細胞或直接修飾相關基因可以提供新的治療策略，並有相當潛力於臨床應用，期望在未來能有好的結果。