產品介紹 代理品牌

【勁報第49期｜建構"內源性蛋白"監控系統！】

　　Promega 傳統冷光或螢光設計，因要對蛋白進行 Tag 標記螢光或是冷光，或是 Promoter 活性的分析，所以設計上多使用外源性載體表現，可進行 Transient transfection 或 Stable clone selection。透過外源性表達可以達到快速分析蛋白表現，但這樣的方式可能與實際生物體的狀況有所差異。自 HiBiT 出現後，原廠便積極導入內源性蛋白研究，除 CRISPR 技術將 Protein Taq 接進去之外(包含 NanoLuc、HiBiT 等…)，也開發出 Lumit 系統，以抗體冷光技術偵測細胞內的蛋白質表現。
　　本篇就是以內生性蛋白分析為主題，透過與傳統外源性蛋白分析比較，了解為什麼要做內生性蛋白分析，並提供建立內源性蛋白標及分析方法，以及最重要的產品應用類別！

 

第一部分、表現 Tagged 融合蛋白的方式

如何表現 Tagged protein 是本文最重要的內容之一，我們比較了以往採載體進行瞬時轉染或是 Stable clone，進行外源性的蛋白研究或是內源性蛋白標定的比較說明及個別優點。

 

1.利用載體轉染 DNA
表現外源性蛋白，操作簡單、彈性，也可以縮短實驗時程。

 

2. 利用 CRISPR/Cas9 方式做內源蛋白標記
以 Knock in 方式將 Reporter 基因，接入蛋白基因表現，可以有效分析內源性蛋白的表現變化。

▲Protein Biology-Common Protein Tagging策略之比較。

 

第二部分、如何快速定量偵測內源性蛋白？

以 Promega 產品可分為兩大類 Protein untagged 及 Protein tagged，分別採用不同的方式來進行偵測，各有用途也各有優點。

1.Protein Untagged偵測方式
使用 Lumit 系統，透過抗體的方式，進行冷光標定偵測，可以取代傳統 Elisa or Western，快速且靈敏度高，利用 NanoBiT 技術進行抗體冷光標定。

▲Limit™ Immunoassays二種偵測內源性蛋白的分析方式。

 

2. Protein Tagged偵測方式
以 HiBiT 及 HaloTag 為主要標記的系統，分別說明不同Tag 的優點。

 

3.如何建立HiBiT Protein Tagging System？
我們也針對如何建立 HiBiT Protein tagged 系統，依不同的方式進行說明，完整介紹整體系統的建立。
   - 自行建立載體系統
   - CRISPR Knock in 系統
   - Ready to use Cell line pool & clon

 

第三部分、 內源性蛋白的應用

內源性蛋白應用在許多應用在之前不同主題的文宣中都有陸續介紹到，因應本次的內源性蛋白檢測，我們將比較新的應用置於前，除產品說明外，也找出應用範例來說明及印證產品效能。

1. Lumit cytokine~Direct/Lumit target protein and phosphorylation~Indirect
Lumit 的偵測方式，後續未有專文針對Lumit不同形式的應用及結果做詳細說明。

▲使用Lumit™ Immunoassay Cellular System 檢測訊息傳遞中NF-ĸB的總蛋白量和蛋白磷酸化程度。

 


2. Target Cell Killing(TCK)
TCK 在抗體藥物及免疫治療中很常見，利用 ADCC 技術將 Effect cell改為 ADCC-qualified PBMC effector cells，再將利用 CRISPR/Cas9 將HaloTaq-HiBiT fusion POI 做成內源性表現，可以專一性檢測 Target cell死亡狀況，不用擔心偵測到 Effector cell 死亡的背景值。

▲(原理圖)HiBT target cell死亡後會釋放出HiBiT fusion protein，加入Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection reagent，其中含有LgBiT可與HiBiT結合，形成完整NanoBiT Luciferase，產生冷光。



3. 細胞表現內源性 HiBiT Tagged 融合蛋白的應用
   - 蛋白表現
   - 蛋白降解&穩定度
   - 蛋白分泌&釋放
   - 受體生物學
   - TCK
   - 蛋白 Knockout Studies
   - 病毒感染

▲Applications of a Bioluminescent Peptide Tag



4. 偵測蛋白表現、降解、分泌與釋放、穩定度與病毒研究
   - Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System (偵測總量蛋白)
   - Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System(偵測細胞膜上或培養基中蛋白)
   - Nano-Glo® HiBiT Blotting System(無須抗體偵測蛋白分子大小與表現量)
   - LgBiT Expression Vector and Stable Cell Line(長時間偵測活細胞內蛋白量)
   - Mouse Anti-HiBiT mAb(使用抗體偵測 HiBiT-tagged Protein)

▲細胞表現內源性 HiBiT Tagged 融合蛋白的應用，可使用上列五種方式進行偵測。

 

總結

　　這次的內容選題，鑒於 Promega 不論是產品應用或是偵測試劑，很多都朝向內源性蛋白的分析。傳統 Elisa 或是 Western 測定標的，都是內源性蛋白的變化，所以 Promega 朝向這個方向開發新的技術，來改善以往技術難以做到的，符合許多研究者的期望 。
　　若您對本期主題:Endogenous Protein Application任何產品有興趣，或對實驗設計有任何想法，歡迎您的專屬業務或撥打免費技術服務專線(0800-231-914)，與我們更進一步討論喔！