Immune Checkpoint Bioassays

Immune Checkpoint Modulation Bioassays

人類免疫系統由複雜的訊號網路所構成，透過免疫細胞表面多種調節受體，來適時的活化或抑制免疫細胞，藉此調控免疫系統的狀態。這些受體接收到細胞外的訊號後，利用下游細胞內Co-inhibitory及Co-stimulatory pathways來保持整體免疫狀態動態的平衡，這些相關的調控機制又被稱做”免疫檢查點”。

Immune Checkpoint Modulation Bioassays以冷光Reporter-based cell為主要核心技術，提供多種免疫檢查點Targets，可用於各種Biologics藥物開發進行專一性的MOA測定，在進行藥物分子結構上或序列的修改後，還可使用此類Bioassay確認藥物的有效性、穩定性…等，得知藥物功能是否因設計上的改變而提升或降低。

Co-inhibitory Receptor Bioassay

Co-inhibitory pathway，包括PD-1/PD-L1、CTLA-4/CD80/86、LAG-3/MHCII及TIGIT/CD155等…，都是熱門且已成功上市的抗體藥物Targets。不管是新藥開發，或是根據已上市藥物做Biosimilar，針對特定Targets開發的阻斷型抗體藥物(Blocked antibody drug )，都必須要建立準確的測試方式，來進行藥物作用的專一性及有效性確認。

此類Bioassay，主要是以兩種細胞來進行:

1. Co-inhibitory effector cell: 帶有冷光Reporter gene，受細胞表面的T-cell receptor (TCR) 調控，同時也表現Co-inhibitory receptor。
2. Co-inhibitory aAPC cell (Artificial antigen-presenting cell): 細胞表面表現TCR activator，以及Co-inhibitory ligand。

aAPC cell上的TCR activator會活化Effector cell TCR signaling，此訊號會刺激Effector cell表現冷光；而Co-inhibitory ligand可與Effector cell上的Co-inhibitory receptor，形成Receptor-ligand interaction，產生抑制TCR signaling的調控訊號，冷光表現隨之降低；此時，加入Anti-Receptor或是Anti-Ligand 抗體藥物來阻斷Co-inhibitory的抑制訊號，冷光訊號得以順利表現，使用冷光檢測試劑即可得知抗體藥物的阻斷效果。

• 靈敏度與專一性高

可正確反應出抗體藥物所辨認的Co-inhibitory targets。(左) CTLA-4 Bioassay；(中) PD-1/PD-L1 Bioassay；(右) TIGIT/CD155 Bioassay。

Co-stimulatory Receptor Bioassay

此類Bioassay將各種Co-stimulatory receptors建立在冷光Reporter T-cell lines上穩定表現，包括GITR、OX40、CD40、4-1BB及ICOS等…，其細胞內的Reporter gene level受Co-stimulatory pathways的調控，當這些Receptors受到外在的刺激，達到活化或抑制的效果後，即可藉由冷光訊號的表現來評估。

Co-stimulatory bioassay 有兩種Co-stimulatory Receptor Bioassays操作方式:

1. Agonist activate: 加入Agonist，測試其活化的功能，例如:
   • Soluble ligand
   • Membrane ligand
   • Receptor-activating agonist antibody (w/ or w/o FcγR-mediated crosslinking)
2. Agonist blocked: 加入Ligand將Co-stimulatory pathways活化，同時用Anti-ligand antibody做阻斷，測試抗體藥物抑制的功能。

• 靈敏度與專一性高

靈敏且專一性的檢測Antibodies against對Co-stimulatory targets的效果，(左) 4-1BB bioassay、(中) GITR bioassay、(右) OX40 bioassay。

Combination Receptor Bioassay

結合兩種Immune Checkpoint所建立而成的 Reporter Bioassay，以PD-1+TIGIT 為例:

♦PD-1+TIGIT Combination Bioassay

此套Bioassay結合兩株細胞: PD-1+TIGIT Effector Cells以及PD-L1+CD155 aAPC/CHO-K1 Cells。

(A)(左) PD-1/ PD-L1結合會抑制TCR pathway，TIGIT/ CD155結合會抑制CD226 pathway，使冷光表現下降。(右)加入Anti-PD-1、Anti-TIGIT抗體，或是兩者都加，可阻斷抑制的訊號，使冷光表現上升。(B圖)使用PD-1/TIGIT Negative cell，則不會發生抑制訊號，並通過TCR pathway以及CD226/ CD155 pathway表現冷光。

• 作為兩種抗體合併治療的效果檢測

使用4種抗體組合進行PD-1+TIGIT Combination Bioassay測試，結果顯示Anti-PD-1(nivolumab) + anti-TIGIT抗體(1:1 ratio)的組別表現出最高的冷光反應，與單獨使用Anti-PD-1或Anti-TIGIT抗體相比有明顯的增強效果，表示使Bioassay可用於檢測Anti-PD-1以及Anti-TIGIT抗體對於T細胞活化的合併效果。

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