原官網的常見問題都先搬到這分類底下

回覆:

不太建議哦.
因為Renilla Luciferase Assay Lysis Buffer(RLALB)是經過優化適合用於此Renilla系統，其他Lysis Buffer可能會影響此assay。

回覆:

Promage rATP, 10mM, 0.5ml 使用nuclease-free water稀釋到可使用的濃度，其保存溫度為–20°C。
做分裝時需使用nuclease-free的tube及 tips，操作時也要小心，避免環境中的ATPase降解ATP。

#廠牌IBA#

回覆:

體積並沒有太大限制，因為流過去純化柱的lysate只有目標蛋白會抓住，只要不要太稀釋HIS-STREPPER，就可以，因為HIS-STREPPER上有一個Strep-tag，若濃度太低，效果則是會變差。此外，也要考慮純化柱可接的最大量，Trial kit附的column是0.5ml，是特殊大小，目的是希望可以多試一點，因此1ml的rein和0.5cc column可放150nmol的目標蛋白。

Protocol是建議使用50ug的HIS-STREPPER可接20nmol的HIS目標蛋白(trial kit 提供150ug的HIS-STREPPER)。當然20nmol是遠低於純化柱本身可接的能力，所以想要更多蛋白，就要使用更多的HIS-STREPPER。

如果客戶的His目標蛋白在N端和C端都接了HisTag，那HISSTREPPER加入的量需不需要double?是否影響抓的蛋白量有多抓、少抓的問題?

回覆:

基本上只要有一端有接到(N或C)就可以了，但有可能兩邊都沒接到，那這樣的就要加倍HIS-STREPPER的用量，但可能同時N和C端都接到，這樣加倍HIS-STREPPER就會浪費，反之，若沒加量HIS-STREPPER，就會有其他目標蛋白可能沒接到，因為無法限制某一端的HisTag不要接，所以只能先試試，若要加量的話建議加量HIS-STREPPER1.5倍的量。

回覆:

從細胞中分離出粒線體後，要注意粒線體保存的sample buffer成分，是否含有會影響CellTiter-Glo reagent的物質。

回覆;

Chroma-Luc 可用於哺乳類，植物系統中，亦可用於益生菌株中，不管用於哪類物種，皆需要相應的promoter來使冷光基因在細胞中表現。
因叩頭蟲冷光基因與螢火蟲基因相似，文獻使用D-luciferin來作為叩頭蟲冷光基因用的sudstrate, 因此建議可嘗試用“VivoGlo(P1041)來進行活體冷光實驗哦。

與ABI的qPCR master mix相比，promega Ct value提早1-1.5個cycle，且螢光有偏弱的現象，因樣本有做三重複，可看出SYBER很穩定，想問如何調整?


回覆:
根據protocol建議，ABI7500/7500FAST是不需要加CXR Dye，因為A6001本身含有low level CXR Dye，所以在上述的儀器中是不需要外加的，若自行外加，CXR濃度過高會導致Ct值延後，因此會建議不要外加，才不會影響Ct值。若今天是使用須外加CXR Dye的儀器(可看protocol有儀器列表)且有Ct延後的問題，可以建議降低CXR濃度，原本是1X的用量，可降低成0.5X試試看，降低CXR Dye濃度，可以讓Ct值提早，但是標準偏差會變大，標準偏差越大，要分辨目標template濃度間的微小區別的可信度就越低。
A6001裡面有一支單獨裝的 100X CXR，是針對在需要高濃度reference dye的儀器上進行檢測時，需另外加入一定體積的染料，用於增加精準度以及校正孔與孔間的螢光訊號誤差，方便針對不同型號螢光定量儀實驗時選擇對應濃度使用。

註:標準偏差是偏差的平方根，是最常用的精確度計量方法，如果許多數據點都靠近平均值，那麼標準偏差就小；如果許多數據點都遠離平均值，則標準偏差就大。

回覆:

cell-base:需做細胞數的曲線以確保冷光值落在線性範圍。
另外也可以使用Purified Caspase Enzyme做titration curve，此曲線可用來推估在細胞中測到的冷光讀值是對應到多少caspase-3 or -7 enzyme的濃度。

enzyme reaction:
除了Enzyme titration curve(選擇性)，需要做的control組及compound test組如下，
• Blank reaction: Caspase-Glo® 3/7 Reagent and vehicle control for enzyme treatment agent or inhibitor, if used
• Positive control: Caspase-Glo® 3/7 Reagent, vehicle control and purified caspase-3 or -7 enzyme
• Experimental reactions: Caspase-Glo® 3/7 Reagent, test compound and purified caspase-3 or -7 enzyme

回覆:

DLR system只建議使用Passive Lysis Buffer(PLB), PLB為最適合DLR system的相容裂解液，確保背景值為最低干擾。

回覆:

Dual-glo reagent配置所需的注意事項:
此套組共有2劑
I : Dual-Glo Luciferase reagent,
II : Dual-Glo Stop& Glo reagent

配置時:

 I : Dual-Glo Luciferase reagent 可先將Dual-Glo Luciferase buffer + Dual-Glo Luciferase substrate混合，invert 至substrate 溶解，再保存於-70度C，可保存6個月，若保存於-20度C，切記不要保存超過一周。此外Dual-Glo Luciferase reagent不可重複解凍超過5次，故建議分裝保存。

 II : Dual-Glo Stop& Glo reagent的配置，建議現配使用，配置方式為Dual-Glo Stop & Glo buffer : Dual-Glo Stop& Glo substrate = 100 : 1 (ex, 6 ml Dual-Glo Stop & Glo buffer + 60 ul Dual-Glo Stop& Glo substrate)。

這兩劑再使用前都需要回溫到室溫做使用，第一劑再溶解時注意溫度不可超過25度C。

回覆:

建議使用Glo-lysis buffer，並follow 以下方式：
Protein Extraction and Luciferase assay:
Cells were then collected by centrifugation, washed in sterile water and suspended in 100 ml of GLO lysis buffer (Promega, Milan Italy) and an equal volume of pre-chilled glass-beads (,0.5 mm, Sigma-Aldrich) was added.

加入Glo-lysis buffer後，同時利用glass-beads將yeast打破，因為yeast的細胞壁較厚，所以只用Glo-lysis buffer的效果會無法完全地將細胞lyse。所以需要mechanical force 去break up the cells.
 

回覆:

Lux operon 及lacZ (-gal)是最早被使用在細菌的reporter gene，其中Lux operon可以做出冷光酶及受質，所以不需而外加受質及可自發性的產光。  

有一些paper是使用Firefly及Renilla luciferase 做為reporter gene，通常會是使用pGL3以前的載體，不使用pGL4載體是因為，pGL4的載體經過優化後更適合用在哺乳類細胞。
若想Promega的試劑做偵測的話，需要自行去optimize 裂解細菌的方法，因為細菌具有細胞壁，所以比哺乳類細胞難裂解，而裂解時間或是方法太過劇烈，也有可能影響冷光活性。另外在裂解細菌的時候，細菌可能會呈現黏稠的不均質狀態，試劑可能無法有很好的反應，所以要特別注意。

這是幾篇使用Firefly及Renilla luciferase 做為reporter gene的reference: 
1.Construction of a bioluminescent reporter using the luc gene and meta-cleavage dioxygenase promoter for detection of catecholic compounds
2.Development and testing of a bacterial biosensor for toluene-based environmental contaminants
3.Activity Screening of Bacteria Containing renilla luciferase plasmid
4.Studies of Dynamic Protein-Protein Interactions in Bacteria Using Renilla Luciferase Complementation Are Undermined by Nonspecific Enzyme Inhibition (不是reporter assay ,但是也是在細菌表現Renilla vector)

回覆:

理論上Vivo-Glo luciferin可以直接用在細胞，但是相關reference都是用在活體。
若是真的要用在細胞上的話，可以參考beetle luciferin的劑量。

以下有三篇文章:

1.Nonhypoxic Pathway Mediates the Induction of Hypoxia-inducibleFactor 1ain Vascular Smooth Muscle Cells
做法：裂解細胞後加入beetle luciferin
配方：20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO3)Mg(OH)2-5H2O (Sig-ma), 2.67 mMMgSO4, 3.1 mM EDTA, 33.3 mM dithiothreitol, 270mMcoenzyme A (Sigma),  470mM beetle luciferin  

2.Upstream Stimulatory Factor-2 (USF2) Activity Is Required forGlucose Stimulation of L-Pyruvate Kinase Promoter Activity inSingle Living Isletb-Cells
做法：移除cell culture medium後，以1X PBS rinse，再加入beetle luciferin
配方：1 mM beetle luciferin (in PBS)

3.The Hepatitis C Virus Core Protein Modulates T Cell Responses byInducing Spontaneous and Altering T-cell Receptor-triggeredCa2Oscillations
做法：移除cell culture medium後，以1X PBS wash，將細胞lyse後再加入beetle luciferin


 

以上3篇的配置方法跟做法都不太一樣，而beetle luciferin配置上原廠是建議使用PBS溶解。

回覆:

Enduren(P1111) is supplied as a lyophilized cake while VivRen (P1231) is supplied as liquid in DMSO. 
EnduRen may have a longer kinetic output while the ViviRen would be brighter than native coelentrazine.

回覆:

EnduRen 及ViviRen在動物體內產生的冷光訊號穩定的時間，會因為施打劑量、使用動物模式不同有關，所以沒有很切確的時間。不過跟傳統的renilla luciferase 的受質coelentrazine比較起來EnduRen產生冷光的時間可以維持較久，而ViviRen則是強度較強。
 
因為這類受質建議以靜脈注射(i.v)注射到動物體內，所以看文章內實線組別。
viviRen的強度較強，而EnduRen的冷光訊號可穩定維持的時間較長。